重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

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1、重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定林辉煌1,2，刘春凤2，尹凤红2，丁玉梅1，陈清西1*(1.厦门大学生命科学学院，福建厦门361005；2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建厦门361028)摘要：本文采用大肠杆菌作为宿主表达重组人白细胞介素-13（rhIL-13）融合蛋白，经分离纯化获得高纯度、高活性的rhIL-13。通过300L发酵罐进行中试发酵表达rhIL-13融合蛋白；经IPTG诱导，离心发酵液收集菌体，菌体经溶解、变性、稀释复性和亲和层析捕获，获得融合蛋白；融合蛋白经肠激酶酶切后，经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤后，获得高纯度rhIL-13原液。每

2、升发酵液可获得高纯度的rhIL-13原液约30mg。通过本纯化工艺获得的rhIL-13原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测纯度大于98.75%；经高效液相色谱分子排阻（HPLC-SEC）法检测纯度结果为100%；质谱法分析rhIL-13分子质量，结果为12348u，与理论值基本一致；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法进行比活性检测，检测结果大于8.0×106IU/mg；采用HPLC法和质谱法对rhIL-13二硫键数目和位置进行了分析，结果显示二硫键数目和位置与理论一致。关键词：重组人白细胞介素-13；纯化；鉴定中图分类号：Q356．1文献标志码：A文章编

3、号：白细胞介素-13(IL-13)是一种多功能细胞因子，主要由T细胞、嗜碱粒细胞、浆细胞及树突状细胞等在活化状态下分泌产生的，尤其是Ⅱ型辅助性T细胞（Th2）[1]。IL-13可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达[2]；抑制LPS诱导的单核因子分泌，控制炎症反应；诱导B细胞增殖及合成IgE类抗体，增强B细胞表面MHCⅡ类分子、CD23及CD72的表达[3]；协同IL-2刺激NK细胞产生IFN，从而促进单核－巨噬细胞活化和TH1型细胞免疫反应。IL-13还具有抑制HIV-1在巨噬细胞内复制，诱导中性粒细胞中IL-1RA基因表达和蛋白质合成等多种功能[4]。重组人白细胞介素

4、-13为一条非糖基化的单链多肽，含112个氨基酸残基，两对二硫键，分子量约为12.3kD；氨基酸序列为：GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN。收稿日期：2016-01-11录用日期：2016-03-08基金项目：国家高技术研究发展（863）计划（2007AA021604）*通信作者：chenqx@xmu.edu.cn11目前重组人IL-13（rhIL-13）基本上都是采用基因工程方法，通过对其c

5、DNA加入特定的标签和引物后，进行PCR扩增，插入到质粒中经DNA重组后，筛选阳性克隆，转化入感受态的细胞中，进行发酵表达获得融合蛋白，再通过对融合蛋白酶切和下游纯化获得IL-13蛋白。本文采用基因工程技术构建的高效表达rhIL-13融合蛋白的表达菌株进行300L发酵融合蛋白，经变性、复性以及亲和层析、分子筛层析等分离纯化后获得高纯度、高活性的rhIL-13，为rhIL-13工业化生产打下坚实的基础。1主要材料大肠杆菌BL-21/pColdⅡ-IL-13基因工程菌株由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品，丙烯酰胺为Promega公司产品；ChelatingS

6、epharoseFastFlow（CS）、Superdex75（S-75）填料为GE公司产品；其它试剂均为国产分析纯。实验使用主要仪器：30L、300L全自动发酵罐，B．BraunBiotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic100蛋白纯化仪，GE公司；LC1200高效液相色谱仪，Agilent公司；autoflexIIITOF/TOF串联质谱仪，BrukerDaltonics公司；DU800紫外/可见光分光光度计，美国贝克曼公司。2实验方法2.1rhIL-13融合蛋白的发酵表达挑取r

7、hIL-13工程菌株BL-21/pColdⅡ-IL-13，按1：400（V/V）接种至100mLLB培养基/1000mL三角瓶，pH6.0、37℃、200~250r/min培养OD600为1左右为一级种；一级种子按1：200（V/V）接种至20LLB培养基/30L种子罐，pH6.0、37℃、200~250r/min培养OD600为10左右为二级种。二级种按1：6（V/V）接种到含120LLB培养基的D300发酵罐中，pH7.0、37℃，溶氧（DO）70%培养、待菌液浓度达OD60