重组人白细胞介素8在大肠杆菌表达鉴定

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1、重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定12【摘要】目的：利用PCR技术[1]扩增hIL-8 cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。方法：PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136

2、大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。 【关键词】hIL-8， PCR ，重组DNA12【Summary】Purpose：ConnectingthehIL-8cDNAwhichisamplificatedusingPCRtechnologywiththeplasmidofprokaryoticexpressionvectordigestedpKpL3a(includingPLpromoter),anddetectingtheexpressionan

3、didentificationofrecombinanthIL-8inE.coli。Method：GettargetgenebyamplificatinghIL-8 cDNAusingPCRtechnology.ExtracttheE.coliplasmid.ConnectthetargetgenewithE.coliplasmidpKpL3aexpressionvector.TransformrecombinationDNAintoE.coliPop2136,andregulategeneexpressionofe

4、xogenoususingthetemperature-sensitiveλrepressorprotein,thendetecttheexpressionlevelsbyELISAreaction。Result：RecombinantplasmidPKpL3awithhIL-8geneissuccessfullytransformedintoE.coliPop2136andexpressesIL-8.TheexpressionleveloftheIL-8isdetectedbyELISAreaction.Concl

5、usion：hIL-8issuccessfullyexpressedinE.coli. 【Keywords】hIL-8， PCR ，RecombinationDNA12白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进

6、行表达和生产[2]。本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。1材料与方法1.1材料试剂⑴模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）；⑵上游hIL-85ˊ引物（agt gct aaa gaa ctt aga tgtTm=56℃，由Takara公司合成）；下游hIL-83ˊ引物（ccg tct aga tta tga att ata agc cct ctTm=56℃，由Takara公司合成）；⑶

7、酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70％乙醇，无水乙醇；⑷缓冲液A（50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液；⑸TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭；⑹LA培养基；LA培养皿；100mMCaCl2；⑺包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.60.05MCBS）；抗体稀释液（pH7.20.01MPBS）；洗涤液（pH7.20.15MPBS）；稀释

8、液（pH7.20.15MPBS）；封闭液（牛血清白蛋白）；底物液（A液：TBM，B液：3％H2O2）；终止液（2mol/LH2SO4）⑻工具酶TaqDNA聚合酶及其buffer：北联生物医学工程公司；dNTPmix：Takara公司；Klenow酶：北联生物医学工程公司，1U/μl；内切酶StyⅠ、XbaⅠ：Takara公司，﹣20℃保存；T4