重组人干扰素a-2b在大肠杆菌中分泌表达

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1、中文摘要目的：依据基因BANK中基因序列设计相应引物克隆出入干扰素a．2b基因序列，构建多种重组人干扰素a-2b的原核分泌型表达载体，转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110的感受态细胞中。分析不同宿主细菌对目标蛋白的表达量和分泌效率的影响，经SDS．PAGE，Westernblot等手段鉴定获得较为理想重组入干扰素a-2b的原核分泌型工程菌株pPSIFN-4L／E,coliW3110。方法：根据大肠杆菌编码基因密码子的偏爱性原则，在不改变hulFN．a2b原有氨基酸序列的前提下，定向突变hulFN．a2b编码基因5’端得序列并且PCR扩增出huIFN．a

2、2b’基因，克隆至pGEM7zf(-)中，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经蓝．白斑筛选及测序验证正确；设计引物从大肠杆菌基因组中克隆出STIl信号肽基因序列，用同样方法验证正确。利用重叠PCR技术实现STII信号肽基因和MFN-a2b’基因的融合，再分别引入酶切位点BamHI／SalI，NdeI／HindlII以及NsiI]XhoI将融合基因片段STII．huIFN-a2b’克隆至载体pCSE、pET-22b和pPAK4L中，构建分泌型表达载体pCSIFN、pESIFN-22b和pPSIFN-4L。pCSIFN转入大肠杆菌W3110，pESIFN-22b转

3、入大肠杆菌BL21，pPSIFN-4L分别转入大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110．诱导表达目标蛋白，将表达产物进行SDS．PAGE，使用WesternBlot免疫印迹法分析验证并用WISH．VSV系统细胞病变抑制法(CPE)来测定表达的目标蛋白抗病毒活性及其效价。结果：融合基因在载体pCSE中表达量很低，其中约有50％的目标蛋白能够成功实现分泌。在EcoliBL21中，pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNa-2b的高表达，但在分泌过程中STII信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在五觥W3110中可以实现huIFNa一2

4、b较高水平的分泌表达，经过低磷诱导其表达量最高可至201ag／ml(A550)菌液，约有30％的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。Westernblot表明目标蛋白具有与huIFN吨2b标准品相同的免疫原性；离心收集菌体，加入～定量的PBS(pH3．0)反复冻融后取上清液，WISH．VSV系统证实其总活性达1．425x1051U／ml，相对的包涵体表达体系作为对照其总活性为1．259x103IU／ml。结论：成功构建5’端突变的hulFN-a2b原核分泌型表达工程菌pPSIFN-4L点W3110，其表达量以及分泌效率均达到较高水平。．coli关

5、键词：人干扰素q．2b；STII信号肽；分泌；大肠杆菌W31103AbstractObjective：AccordingtogeneBANKsequenceofhumaninterferona-2bgene，weclonedhumaninterferona-2bgenefragmentandconstructedprokaryoticsecretionexpressionvectorsofhumanhuIFNa一2b．ThentranfonnedthesevectorsintocompetentcellsfromE．coliBL21and点．coliW310

6、respectively．Thesevectorsindifferenthostsexpressthetargetproteinisnotthesameinamountandsecretionefficiency．WegetthepPSIFN一4L／EcoliW310systemasthebestchoicethroughtheidentifymethodsofSDS—PAGEandWestern-Blot．Methods：Mutatedthe5’endgenesequenceofhuIFN-a2bcodegenebysite-directedmutagen

7、sisandamplifiedit、析thPCRaccordingtothefrequencytablegenecodoninZ．coliwithoutchangeitsaminoacidcompsition，andthenclonethegeneintosequencingvectorpGEM·7zf(-)，andthevector、析tllmutatedhuIFN-a2bgenesWastransformedintocompetentcellof五．coliDH5a．Thepositivecloneswereidentifiedbyblue-whites

8、creenandDNAsequencing；Desi