重组人白细胞介素18在原核系统中高效表达的策略

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1、重组人白细胞介素18在原核系统中高效表达的策略作者：杨京生，田生活，全家妩【摘要】目的探索并建立人白细胞介素18（hIL-18）的原核高效表达系统。方法设计特异性引物，以RT-PCR从外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素18成熟肽片段，克隆进入PBV220载体。以DNAWORK软件和RNADRAW软件进行ＲＮＡ结构和自由能优化；通过合成寡核苷酸和overlapPCR技术将hIL-18cDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子；酶切连接构建原核表达载体并与优化前序列比较它们在宿主菌中诱导表达结果。进而对表达条件进行了优化。表达产物经SDS-PA

2、GE和WesternBlot鉴定。结果扩增人白细胞介素18成熟肽基因序列测定正确，同时获得氨基酸密码子比例适合于大肠杆菌原核表达的突变型IL－18序列。构建的原核表达载体PBV220/mhIL-18和PBV220/ohIL-18在大肠杆菌中获得有效表达，目的蛋白的产量在相同条件下优化型比野生型序列增加达3倍，WesternBlot鉴定正确。结论根据使用的载体/宿主系统，对ＲＮＡ结构和自由能优化、稀有密码子突变产生影响并能有效提高目的蛋白的表达。【关键词】人白细胞介素18；稀有密码子；优化密码子；overlapPCR；表达15Highexpression

3、ofrecombinanthumanIL-18expressioninpronucleussystemthroughoptimizedcondon【Abstract】ObjectiveHighexpressionofrecombinanthumanIL-18expressioninE.coli.MethodsTheyieldofcombinanthumanIL-18expressioninE.coliremainsquitelowbecausethesequenceofmaturehIL-18has37aararecondonsforE.coliina

4、totalof157aa.Toovercomethisproblem，genesynthesiswasperformedwithoptimizedcondonsfortheexpressionhostE.colithroughoverlapPCRusingsixsynthesisDNAfragmentsof95-101residueshaving22-24residuesoverlaps.ResultsThefinalyieldofIL-18withoptimizedcondonswasaboutthreetimeshigherthantheyield

5、withthenativesequence.ConclusionTheapplicationoftheabovetechniguemaybeincreasedthegoalproteinexpressioneffectively.【Keywords】hIL-18;optimizedcondon;rarecondon;overlapPCR;expression1995年Okamura等发现用痤疮丙酸杆菌处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-γ。因其可诱导IFN-γ的产生，称之为γ干扰素诱生因子［1］。IGIF与IL-12在功能上有相

6、似之处，15且在IFN-γ的诱生上两者有协同效应，但两者的分泌途径却各不相同。基于IGIF功能上的多效性，将其命名为白细胞介素18。IL-18是18.3kD的蛋白质，它对多种细胞尤其是免疫细胞具有多向性作用，如诱导免疫细胞产生IFN-γ、增强NK细胞和CTL细胞的活性、促进IL-2介导的T细胞增殖、增强Th1单克隆和富集的多克隆T细胞产生Th1类细胞因子、促进Fas配体（FasL）在T细胞表面的表达、增强Fas介导的细胞毒作用等。IL-18的许多功能与IL-12相似，在某些方面作用甚至更强，因此被认为是一种潜力极大的增强机体抗肿瘤免疫能力、抗微生物、抗

7、自身免疫疾病的细胞因子，目前国外已经完成其一期临床，进入二期临床研究阶段。IL-18是以非活性的前体形式合成，然后通过白细胞介素1β转移酶（ICE）在天冬氨酸位点上水解，去除含有36个氨基酸的前导序列，成为成熟的IL-18而发挥生物学活性。成熟的人IL-18的长度分别为157个氨基酸。它们的分子中没有Ｎ-糖基化位点，不存在二硫键，很可能巯基（-SH）就是分子的活性中心。表达产量是影响工程化生产的重要因素之一,通过反转录PCR扩增出人白细胞介素18成熟肽基因片段,将其中的原核稀有密码子突变为高频同义密码子,并进行RNA结构和自由能优化,经筛选,最后获得了

8、高效表达的序列,表达产量在相同条件下比野生型序列增加达3倍。1材料与方法［2］151.1质粒和