次级淋巴趋化因子SLC的克隆及其在原核系统中的表达

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1、!"卷#期生物工程学报&’()!"*’)#$%%!年"月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+,(-$%%!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!次级淋巴趋化因子!"#的克隆及其在原核系统中的表达!，$$""!!$"王东宁李明峰曾而良张惟杰吴祥甫（!上海交通大学生命科学与技术学院，上海$%%%/%）（$中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海$%%%/!）摘要以中国人的淋巴组织为材料抽提总C*D，用C1.EFC的方法扩增了次级淋巴组织趋化因子（G2B

2、’@H7I-(-:.JA’;H.K;??,2BA2:’L;@2，GMF）的成熟肽基因。序列分析表明，我们克隆的GMF基因与文献报道的仅有一个核苷酸的差异，且并不影响氨基酸的编码。将GMF的BN*D插入含1"启动子的表达载体J91.$3（7O）中构建重组质粒J91.GMF，转化大肠杆菌PM$（!N9/）筛选表达菌株。表达菌株经!::’(QMRE1S诱导表达/T4A后，超声破菌，离心后将上清进行GNG.EDS9，可以看到在!3LN左右处有明显的表达条带。用*;$O亲和层析柱纯化表达产物，纯度达到5%U以上。关键词次级淋巴组织，趋化因子，克隆，表达，趋化作用中图分类号V"35文献标识

3、码D文章编号!%%%./%0（!$%%!）%#.%/5$.%#［3］次级淋巴组织趋化因子（G2B’@H7I-(-:JA’;H.K;.受治疗鼠的#%U获得了完全的肿瘤根除。??,2BA2:’L;@2?，GMF）是人们最近发现的一种起源于我们以中国人的组织为材料，通过C1.EFC的内皮细胞的FF型趋化因子，它的存在可使机体内1方法扩增了GMF基因，并与国外报道的同源基因序［!］淋巴细胞产生极高效的趋化作用。研究表明GMF列做了比较，证明了该蛋白的保守性。同时我们首在人体的淋巴结、阑尾以及脾脏等组织中有较高的次尝试了将该基因在原核系统中进行表达并纯化了表达。*7W;I7等人于!55"

4、年首先发现了这一新的因表达的产物。这使得通过一种简单而便于扩大生产子，随后人们在确定了其基因序列的基础上成功地的表达系统获得大量GMF重组蛋白变为可能，为日通过P7B.K’.P7B系统将其在真核细胞中加以表达，后研究GMF蛋白的结构与功能及开发一种具有抗［$］并纯化。之后人们又陆续对真核表达系统产生的肿瘤活性的新型药物奠定了基础。重组GMF蛋白的功能及其体内趋化作用作了较深［/T"］$材料与方法入的研究。研究已表明GMF由!/#个氨基酸残基组成，其$%$材料中$/个氨基酸为信号肽序列。!!!个氨基酸的成肿瘤患者淋巴结由上海市第九人民医院手术室熟肽含有#个半胱氨酸残基，与其他人类

5、FF型趋提供，大肠杆菌1S!，PM$!（N9/），质粒载体JP(,2.化因子有$!UT//U的同源性。然而这种新型的GBI;JK!.GX、J91.$$Y、J91.$#7、J91.$37由本室保存；［$］趋化因子只能特异地趋化淋巴细胞。焦碳酸二乙酯（N9EF）为6(,L7公司产品；N*D限制正是由于GMF在体内对于1A!淋巴细胞和树突酶，1#N*D连接酶，X(2@’=酶，17ZN*D聚合酶及状细胞的趋化作用，促使人们联想到通过局部瘤内BN*D合成试剂盒为S;YB’PCM公司产品，测序试剂用药的方法来提高肿瘤组织周围的淋巴细胞数量，盒与总C*D抽提试剂盒为EI’:2W7公司产品，[

6、.从而达到用免疫治疗法攻克肿瘤的目的，目前国外S7(、RE1S为P’BAI;@W2I:7@@A2;:产品。在模型动物的治疗方面已取得可喜的效果。有报道$%&淋巴结组织总’()的抽提表明，用重组的鼠源GMF对肿瘤进行瘤内注射，使将手术取下的新鲜淋巴结组织剪成小块，取收稿日期：$%%%.!!./%，修回日期：$%%!.%/.!0。"通讯作者。12(：30.$!.0#/"##/%.4$5$；678：30.$!.0#//3/4"；9.:7;(：8<=,>?,@:)?AB@B)7B)B@""现工作单位：解放军四五五医院。3期王东宁等：次级淋巴趋化因子F1/的克隆及其在原核系统中的表达72

7、7!"#$左右的组织于液氮中研磨成粉末，总%&’的疫治疗中确实有较强的功效。抽提按照()*#+$,总%&’抽提试剂盒的说明进行。4"!()*扩增.6)基因片段!"#$%&’合成和()*体外扩增从淋巴结组织中抽提总%&’后，反转录成-.&’合成按照试剂盒推荐的方法操作。(/%-.&’作为模板。根据&,$5),等报道的人类F1/基［0］反应以0!1-.&’为模板，反应体系参照文献［2］，反因中的成熟肽序列，我们设计了一对引物：应条件按常规设置进行：先将(/%反应混合物于引物8：!MGCD/’C’