pET系统原核表达手册

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1、pETSystemManual第10版pET系统操作手册于2002年7月修订完成。Novagen一直致力于研制开发pET系统，并将pET系统的新进展编入本手册。欲获取pET系统的任何最新资讯，请随时登录Novagen网站www.novagen.com。内容提要内容提要1I.系统介绍4A.概况4B.使用许可及协议4C.系统组成4D.选择合适的pET载体4基本考虑因素5蛋白溶解性及细胞定位5融合标签5各种pET载体特性列表7E.pET载体克隆策略8制备不带融合标签的天然蛋白8制备以蛋白酶切去融合标签的天然蛋白9不需连接反应的克隆方法(LIC)9F.pET系统蛋白表达的调控10T7l

2、ac启动子10pLysS和pLysE宿主菌10载体与宿主菌共同影响表达水平10含葡萄糖的培养基11pLacI宿主菌11pETcoco™系统11G.用于克隆的宿主菌11H.用于表达的宿主菌12蛋白酶缺陷型12调节培养体系中所有细胞的表达水平12二硫键的形成及增加蛋白可溶性12补充稀有密码子13硒代甲硫氨酸标记13pET系统各种宿主菌特性列表14I.抗生素抗性16J.CE6噬菌体16K.诱导对照17II.建立原核表达体系的基本知识18A.pET系统操作流程18B.生长培养基19C.菌株保存20D.制备载体21E.制备插入片段22III.目的片段克隆23A.连接反应23B.转化23操

3、作小诀窍23操作步骤24铺板技术25默克中国操作手册TB055第10版1免费技术咨询热线800-820-8872上海代表处021-62483388北京代表处010-85802406广州代表处020-83634531Novagen网站www.novagen.combioteam@merck-china.compETSystemManualC.pET重组子分析25用EcoPro™系统分析转录/翻译水平26质粒模板26PCR模板26转录/翻译分析的连接PCR28转录/翻译分析的菌落PCR29菌落筛选29质粒制备30测序30IV.表达目的基因30A.转化表达用宿主菌株31B.DE3溶原

4、菌的诱导31诱导的准备工作31诱导的操作步骤31V.优化表达条件32A.增加蛋白溶解性及折叠32温度31裂解缓冲液32细胞周质定位32细胞质定位33宿主菌33B.稀有密码子34C.毒性基因及质粒不稳定性33氨苄青霉素的使用35补充葡萄糖35质粒稳定性测试34稳定甘油菌株保存过程中氨苄抗性pET载体上的毒性基因的措施35稳定诱导过程中氨苄抗性pET载体上的毒性基因的措施35D.影响表达的其它因素36N-端原则36二级翻译起始位点36mRNA转录产物中的二级结构37意外终止密码子37转录终止子37不稳定的目的mRNA及蛋白37VI.目的蛋白分析38SDS-PAGE电泳上样体积标准化

5、38生长和诱导38诱导培养物的光密度分析38A.用PopCulture™快速分析蛋白表达水平、活性及可溶性39B.细胞总蛋白组分39C.培养基组分39D.细胞周质组分40E.细胞质可溶部分组分41®®BugBuster和Benzonase核酸酶处理41rLysozyme™溶液和冻融处理42机械破碎43F.细胞质不溶部分组分43®BugBuster试剂处理后的包涵体纯化43机械性裂解细胞的包涵体纯化43G.用PopCulture™试剂制备抽提物44默克中国2操作手册TB055第10版免费技术咨询热线800-820-8872上海代表处021-62483388北京代表处010-858

6、02406广州代表处020-83634531bioteam@merck-china.comNovagen网站www.novagen.compETSystemManualVII.目的蛋白的鉴定和定量45A.标准SDS-PAGE凝胶电泳上样495B.融合标签的检测/分析工具46VIII.目的蛋白的纯化47A.纯化工具48B.溶解与重折叠50IX.诱导对照：β－半乳糖苷酶重组物50?β－半乳糖苷酶分析50X.pET系统宿主菌以及λ噬菌体51用于蛋白表达的lDE3溶原菌51用于初始克隆、对照和表达的同基因宿主菌53pET系统宿主菌感受态细胞套装产品54pET系统的?噬菌体54XI.附录

7、：基因蛋白功能研究产品基因突变产品大全蛋白质相互作用双杂交系统T7噬菌体展示系统基因沉默研究产品·关于pET系统的所有产品的专利、商标信息请参考Novagen原版目录。·Novagen是德国MerckKgaA集团子公司EMD公司的品牌之一。·所有Novagen出售的产品仅供科研之用。默克中国操作手册TB055第10版3免费技术咨询热线800-820-8872上海代表处021-62483388北京代表处010-85802406广州代表处020-83634531Novagen网站www.nova