《原核表达系统》PPT课件

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1、原核表达系统基因公司技术讲座原核表达系统分类分类方式分类表达调控方式组成型，诱导型表达产物定位分泌型，不分泌型（细胞内、细胞膜、周质空间）产物纯化方式是否融合蛋白、是否一步亲和纯化产物溶解状况可溶、包含体、分泌型GeneCompanyLimited基因有限公司基因功能研究重组蛋白特性研究重组蛋白制备/制药主要用途GeneCompanyLimited基因有限公司NEB公司的IMPACTTM系统InteinMediatedPurificationwithanAffinityChitin-bindingTag采用了最新的“可诱导的内含肽自身剪切”技术，使内含肽在适当的pH或

2、还原条件进行自身剪切，无需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲和层析从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率。InteinCBDMCSTargetGeneChitinBindingDomainChitin-boundinteintagMultiplecloningsite世界首创独家提供内含肽（Intein)内含肽是一种蛋白剪切元件（Proteinsplicingelement),是一些读框区中打断宿主基因编码区的序列。与内含子(Intron)不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切机制从蛋白前体中被剪切的。InBase(TheInteinDatabas

3、e)NEB’swebsite:TechnicalResourcesectionIMPACT-CN系统特点操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合目的蛋白产物序列不变一步亲和纯化——无需另加蛋白酶除亲和标记严谨的转录控制目的蛋白能够进行C端标记独家的Intein介导的肽连接技术（IPL）IMPACT-CN系统流程IMPACT-TWIN系统特点操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合目的蛋白产物序列不变一步亲和纯化——无需另加蛋白酶去除亲和标记可选择硫醇试剂或pH和温度条件诱导Intein自身剪切IPTG诱导的T7启动子，可实现高水平表达

4、及严谨的表达调控唯一可直接产生带N端Cys和C端硫酯的蛋白的表达纯化系统纯化产物可方便地进行标记、连接及环化等操作独家的Intein介导的肽连接技术（IPL）GeneCompanyLimited基因有限公司IMPACT-TWIN系统流程GeneCompanyLimited基因有限公司ProteincyclizationGeneCompanyLimited基因有限公司GeneCompanyLimited基因有限公司NEB公司的IMPACTTM系统载体选择pMAL蛋白融合及纯化系统特点表达量高，稳定可靠经验证，75%以上的样本产量高达100mg/L产物可分布细胞质或周质空

5、间分布周质空间可增强有二硫键的蛋白的折叠与MBP融合可增加表达蛋白的溶解性温和洗脱条件不用去垢剂及强烈变性A1:未诱导细胞A2:诱导细胞B1:直链淀粉柱第一次纯化B2:FactorXa处理后B3:直链淀粉柱第二次纯化pMAL-C2:无信号顺序，融合蛋白产物定位于细胞质中pMAL-P2:含信号顺序，融合蛋白分泌表达于细胞周质载体选择PROBacterialExpressionSystemGeneCompanyLimited基因有限公司-----CLONTECH-----特点严谨调控，高水平诱导表达新型的杂合启动子和操纵子，低背景，高表达，调控精确，可用于有毒或抑制生长的

6、蛋白表达。产物便于纯化N-端带有c-Myc亲和标记和肠激酶位点改造方便载体的三个主要的功能区各配有单一酶切位点，用户可根据需要对载体进行改造。PROBacterialExpressionSystem-----CLONTECH-----GeneCompanyLimited基因有限公司PROBacterialExpressionSystemSimultaneous,independentexpressionoftwoproteinsThepPROTet.E332-lacZandpPROLar.A222-LucControlVectorsweresimultaneously

7、propagatedinDH5αPRO-----CLONTECH-----GeneCompanyLimited基因有限公司HATProteinExpression&PurificationSystem-----CLONTECH-----GeneCompanyLimited基因有限公司特点可在中性pH条件下纯化蛋白有效去除杂质纯化可采用变性或非变性条件降低蛋白酶活性，提高蛋白稳定性提供纯化的专用树脂：TALON®IMAC钴离子高度专一地亲和HAT和其它6×His蛋白，且洗脱条件温和，保证蛋白完整性pHAT-GFPuv载体还带有荧光标记极大的方便了表达产