pET原核表达系统

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1、pET原核表达系统一、基因表达系统•随着分子生物学研究不断深入，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。•现有外源基因表达系统主要包括:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫杆状病毒、动物乳腺生物反应器及植物表达系统等。•大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、可以高效表达不同外源基因产物等特点,是许多外源基因表达系统中最好的一种。外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为

2、安全的基因工程受体生物外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素二、基因表达方式•根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为：组成型表达诱导或阻遏型表达协同表达组成型表达（constitutivegeneexpression）•在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变化很小。且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少的，

3、这类基因通常被称为持家基因（housekeepinggene）。•举例：HomosapiensribosomalproteinS27a(RPS27A),mRNA4156Homosapiensactin,beta(ACTB),mRNA6988HomosapienslactatedehydrogenaseA(LDHA),mRNA2105诱导和阻遏表达（Induction&Repression）•诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导（induction）。举例：

4、lac操纵子•阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression）。举例：trp操纵子协调表达（coordinateexpression）•在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。三、乳糖操纵子结构质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子（标记基因）目的片段选择标记载体表达载体(expressingvector)•特点：带表达构件—转录和翻译所

5、需的DNA序列•大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号–启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体P启动子、T7噬菌体L启动子–核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列–转录终止序列四、pET原核表达系统概况•pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。•目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建

6、的表达系统称为T7表达系统。T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型T7启动子目的基因温度诱导型双

7、质粒系统T7RNA聚合酶？启动子T7RNA聚合酶基因T7表达系统E.Coli（DE3）转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生T7启动子目的基因株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的T7RNADNA片段被插入其int基因中聚合酶IPTG诱导用噬菌体DE3的溶源菌作为表lac启动子T7RNA聚合酶基因达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。T7表达系统E.Coli（CE6）转录调控的机理温度诱导型P启动子控制T7