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1、XX大学毕业论文重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达2014年6月25日重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达作者：杨莉莉，魏枫，刘虹，李慧，于津浦，任秀宝【摘要】廿的：构建人白介索18(hIL18)真核表达载体，在毕赤酵母中高效分泌表达hIL18。方法：通过PCR法扩增得到hIL18基因，构建其真核表达载休pPICZaC/hIL1&电转化毕氏酵母X33,PCR、SDSPAGE、Westernblot等方法筛选获得高效表达rhIL18的工程菌株，疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物，并初步测定其生物学活性。结果：rhIL18经甲醇诱导后其表达产量约为202mg/LoW
2、esternblot检测了rhIL18的特异性结合活性;rhll18纯化后纯度达95%左右，并证明rhIL18能够协同IL2诱导PBMC分泌IFN丫。结论：构建了重组hIL18的基因工程菌，并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究英活性和功能奠定了基础。【关键词】人白细胞介索18;毕赤酵母；表达；纯化口细胞介素18(IL18)/乂称IFN丫诱导因子(IGIF),主要由巨噬细胞产生的细胞因子［l］o人IL18前体蛋白由193个氨基酸组成，天然IL18的活化依赖丁IL1转化酶(Interleukin1conversingenzyme,ICE)的特异裂解作用，从询体IL18的N
3、端切除36个氨基酸残基而使之活化［2］oIL18的生物学活性与IL12相似，能促进T细胞增殖，诱导T细胞分泌IFN丫、GMCSF,抑制IL4和IL10产生，增强NK及Thl细胞的细胞毒活性等;IL18的表达还与自身免疫病、肿瘤及感染冇关［3,4］,IL18在抗肿瘤及抗病毒等方面具有潜在的应用前景［5,6］。目前关于IL18制备的报道主耍集中在原核表达体系［2,7］,但出于原核表达体系产量较低，且存在复性得率低等一些问题，使得其生产成木较高。为了更好的研究hIL18特性，探索新的生物学活性，我们在真核表达休系毕赤酵母中表达hIL18,试图得到大量hIL18蛋白，更好的开展hIL1
4、8体内或体外活性研究。本研究从胎儿肝脏组织克隆了人IL18成熟肽(即从第37位氨基酸到193位氨基酸)基因，构建了真核重组表达质粒，利用毕赤酵母0（交配因了信号肽引导重组hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表达，探索了纯化方法，并对其活性进行了初步研究。1材料和方法1.1材料pPICZaC质粒和毕赤酵母菌株X33购门Invitrogen公司;E.coliDH5a购自北京鼎国生物公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；限制性内切酶及T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；PhenlySepharose6FF,QSepharoseHP购于美国GE公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院
5、血液学研究所；山羊抗人IL18抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊IgG抗体购口SantaCruz公司。口动玻璃发酵罐（KLF2000型）为瑞士比欧（Bioengineer）公司产品；蛋白纯化仪（型号AKTAexplorer10）为美国GE公司产品。1.2方法1.2.1hIL18基因的克隆及载体构建提取胎儿肝脏组织RNA,以其为模板，根据GenBank公布序列（AccessionNo.BC007007.）设计引物，上游引物为5，CCGCTCGAGAAGAGATACTTTGGCAAG3,下游引物为5’GCCGCTCTAGATTAGTCTTCGTTTTGAACAG3（Xho
6、I和XbaI划线所示）,PCR扩增得到含hIL18成熟肽基因片段。为了终止C端Histag的表达，下游引物中XbaI的而面加入终止密码了。PCR扩增产物用XhoI和XbaI酶切庇连于用同样酶切的载体pPICZaC得到质粒pPICZaC/hIL18。连接产物转化人肠杆菌DH5a,涂于含25mg/LZeocinLB平板上，切鉴定转化产物并测序，提取鉴定正确的阳性克隆质粒用于表达。1.2.2质粒pPICZaC/IL18的转化及鉴定将重组表达质粒pPICZaC/hIL18以PmeI线性化，纯化回收。将15
7、ig线性pPICZaC/hIL18电转化至新鲜制备的酵母感受态细胞X33屮，并同
8、吋转化空质粒pPICZaC和空酵母菌作对照，转化产物涂布于YPD平板（Zeocin的浓度为100mg/L）。28°C培养2〜3d至长出菌落。在YPD平板(Zeocin抗性)上挑取20个克隆，提取转化的毕赤酵母菌基因组DNA,以其为模板，以上面提到的特异引物进行PCR鉴定，并以未转化的酵母菌基因组DNA和空质粒pPICZaC转化的酵母菌基因组DNA作对照,PCR鉴定质粒pPICZaC/hIL18是否稳定转化。1.2.1摇瓶环境rhIL18的表达经鉴定的重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X3
