trail在人三原核胚胎中的表达

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1、TRAIL在人三原核胚胎中的表达第27卷第12期Vo1.27.No.122007年l2月Dee.2007生殖与避孕Reproduction&Contraceptionhttp://www.RandC.cnrandc@sippr.stc.sh.crlTRAIL在人三原核胚胎中的表王昕荣,陈雯张娟1任新玲1胡娟1(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心,武汉,430030)(2.山东烟台毓璜顶医院生殖中心,烟台,264000)达朱桂金1【摘要】目的:探讨TRAIL在人类胚胎凋亡中的作用.方法:用免疫荧光法检测nIL在正常发育阻滞和有细胞碎片3种不同发育状态的人类3原核

2、(3PN)胚胎中的表达,并用Hoechst33342染色观察核凋亡.结果:TRAIL在3组胚胎中均有表达,有碎片的3PN胚胎中1]RAⅡ,的表达较其他二组明显增强,碎片组核凋亡明显增加.结论:TRAIL在人类3PN胚胎凋亡中有一定作用.关键词:TRAIL;胚胎:人中图分类号:R321—33文献标识码:A文章编号:0253—357X(2007)12—0768—04胚胎质量是辅助生育技术成功的关键影响因素之一,然而在胚胎发育中,经常会有胚胎发育阻滞或细胞碎片的发生,导致细胞凋亡,严重影响胚胎质量【l'2】.目前研究认为细胞碎片的产生与患者年龄,卵巢功能以及促排卵药物的作用等有关,但是

3、导致其胚胎凋亡和细胞碎片产生的分子机制目前尚不清楚【3】.为此,我们选用了无移植意义的人3原核(threepronucleizygotes,3PN)胚胎进行研究,检测了肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNFrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)在不同发育状态胚胎中的表达.1材料与方法1.1一般资料2006.04.20-2006.05.31期间在本院生殖中心进行的2l1个IVF治疗周期,患者平均年龄31.0±5.8岁.其中IVF—ET157个周期,ICSI35个周期,本课题为中国博士后基金(N0,2o03O34475)和教育部留学回国人

4、员科研启动基金(教留外司(2OO4)527号)通讯作者:朱桂金:Tel:+86-27-83662822;E-mail:zhu_guijin@sina.corn——768-附睾或睾丸穿*IJ(PESA/TESE)取精,行ICSI6个周期,其他周期l3例,共取卵2l55个,平均每周期取卵数为1O.2个,其中,3PN以上胚胎224个,发生率为l0.4%.1.23PN的收集与分组取卵后常规培养,受精d2观察发现3个原核的胚胎,即为3PN胚胎.每天观察记录胚胎情况,常规培养至受精d3.常规移植和冷冻可用胚胎,收集无移植意义的3PN胚胎用于本研究.本研究经过本院伦理委员会批准,且捐3PN胚胎

5、者签订知情同意书.将3PN胚胎按以下标准进行分组【3】,A组:发育正常的胚胎:B组:发育阻滞的胚胎即培养d2,d3观察胚胎细胞增加数≤l:C组:细胞碎片>2O%有碎片的胚胎.1.3免疫细胞化学步骤①制备适宜内径的玻璃吸管.将不同组的胚胎分别置于Tyrode'S酸(pH2.卜2.5.Sigma公司)中轻轻吹打数秒钟,除去透明带及其附着的精子,PBS洗5min×次.②将3PN胚胎放入含0.02%的TritonX一100(Sigma)和4%多聚甲醛的PBS中5min×3次.③将TRAIL抗体(武汉博士德生物有限公司)1:5O稀释后加入O.3%的牛血清白蛋白(BSA),与3PN胚胎

6、一起4℃孵育过夜,PBS洗5min×3次.④加入到1:50的异硫氰酸荧光素羊抗兔IgG(FITC,北京中山生物技术有限公-.-])--抗中,37*C孵育45min,PBS洗5min×3次.⑤将胚胎置于1的Hoechst33342溶液(Sigma)~复染15min.⑥在O.O1%的Tween-20中冲洗数次后,整装压片.用NikonECLIPSE80I荧光显微镜在蓝色激发光下.绿色荧光为TRAIL表达阳性,并用E5400数码相机(Nikon)拍照.计数各组胚胎的阳性细胞率.具体计算方法为:阳性细胞率=阳性细胞数/胚胎细胞总数.用荧光显微镜观察.根据胚胎细胞核染色质凋亡分级.计数各组

7、同级别的凋亡细胞数目.1.4细胞核染色质形态学分期根据Wyllie等学者的研究,将细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为3级【4】:I级:细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态;II级:细胞核的染色质高度凝聚,边缘化,形成新月体或帽装结构聚集_丁核膜一卜;III级:细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体.1.5统计学处理所得数据采用SPSS11.0软什进行)c:检验,P<O.05认为差异有统计学意义.2结果2.1TRAIL的表达TRAIL主要表达在胞质和胞膜.正常对照