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《猪防御素基因pbd-2在大肠杆菌中的重组和融合表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、猪防御素基因pBD-2在大肠杆菌中的重组和融合表达中国畜牧兽医2011年第38卷第5期生物技术?101?猪防御素基因pBD一2在大肠杆菌中的重组和融合表达徐海涛,马立保,何启盖,廖冰麟,任芬芬.(1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉430070;2.华中农业大学动物科技学院,湖北武汉4300703.湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙410128)摘要:哺乳动物防御素是动物机体在抵御病原微生物的防御反应中产生的一类重要的抗菌肽物质,具有十分广泛的抗菌谱,在先天免疫上起重要作用.本研究根据已报道的pBD一2
2、基因cDNA序列,合成了3条基因片段(1,2,3).片段1,2和片段2,3各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2基因,将pBD一2基因克隆至原核表达载体pGEX—KG.成功地在大肠杆菌BI21(DE3)中表达出pBD-2融合蛋白.pBD2基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性打下了基础.关键词:猪8一防御素一2;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1671-7236(2011)05-0101-04近年来,由于药物的滥用,尤其是抗生素的滥用,使得药物残留,细菌耐药性等问题日趋严重,不仅困扰
3、着世界养殖业,也引发了人们对动物源性食品安全的关注.欧盟已从2006年1月起,全面禁止在饲料中投放多种抗生素添加剂,开发新一代的抗菌药物已成为新的研究热点.以防御素为代表的抗微生物肽类有着广阔的前景,它们能快速杀死病原微生物,与抗生素相比,不易产生耐药性,而且对其有抵抗力的细菌较少.防御素的广谱抗微生物活性预示了一条开发新型的,理想的抗微生物药物的途径.虽然防御素广泛分布于动物的胸腺,脾脏,肝脏,舌等器官和组织细胞中,但动物体内天然防御素的表达量低,分子质量小,分离困难,而化学合成防御素成本又太高,利用分子生物学技术重组表
4、达外源基因已成为获取目标蛋白(防御素)的有效途径之一.本研究参照含有36个氨基酸的hBD-1成熟肽序列,设计了能编码36个氨基酸的pBD一2基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达pBD一2蛋白.1材料与方法1.1材料1.1.1质粒与菌株原核表达载体pGEX—KG,大收稿日期:20101027作者简介:徐海涛(1981一),男,湖北人,硕士生,研究方向:单胃动物营养.通信作者:马立保,副教授,硕士生导师.E—mail:malibao@l26.COrn.cn何启盖,教授,博士生导师.Email:heqigai@yahoo.c
5、om.cn基金项目:国家生猪产业体系技术建业项目(nycytx-009).肠杆菌BI21(DE3)均由华中农业大学动物医学院传染病室保存.1.1.2主要试剂基因片段合成,重组质粒测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供,DNA胶回收试剂盒BioFlux公司,DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司.1.2方法由于pBD-2的成熟肽位置尚未报道(Veldhuizen等,2008),无法准确预测.而pBD一2氨基酸序列与hBD-1氨基酸序列同源性高达6O%,并被认为是hBD-1的直系同源基因(Sang等,2006);因
6、此本试验在设计pBD一2基因片段时,参考了已报道的含有36个氨基酸的hBD-1成熟肽序列(图1),以期表达出含有36个氨基酸的pBD一2.hBD—lDHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK图1hBD-l成熟肽序列1.2.1猪pBD-2基因片段的设计根据NCBI报道的SUSscrofabeta—defensin2(pBD一2)基因(GenBank登录号:NM一214442),结合大肠杆菌密码子偏爱性,将基因序列中编码第4个氨基酸的ATA改为ATC,编码第22个氨基酸的AGG改为CGC,但所编码
7、的氨基酸保持不变.根据碱基改动后pBD一2基因cDNA序列,应用生物设计软件,设计3条基因片段.在片段1的5端引入BamHI酶切位点及3个保护性碱基,在片段3的5端引入Hindm酶切位点及3个保护性碱基,设计好的DNA片段送上海生工生物工程技术服务有限公司?102?生物技术中国畜牧兽医2011年第38卷第5期合成.片段序列如下:片段1:5一ATG△!AT～GGACCACTACATCTGTGCCAAGAAAGGGGG～GACCTGCAACTTCTCCCCC一3;片段2:5一ACT～GTAACAGGTCCCTTCAATGCGG
8、TTGAAGAG—CGGGCAGGGGGAGAAGTTGCA一3;片段3:5一ACTAAGCTTTCAGATGCAGCACTTGGCCTTGC～一================CACTGTAACAGGTCCC一3(单横线标记的碱基为保护性碱基,双横线标记的碱基为酶切位点).其中,片段1,2的3端有15
