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时间:2018-07-30
《人体β防御素突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、人体β防御素3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达【摘要】 目的从人正常皮肤组织中提取β防御素3基因进行定点突变后在中融合表达。方法从人正翅常皮肤组织中提取总RNA勇,经RTPCR扩增得到!编码β防御素3成熟肽テ的cDNA序列,测序正确怼后,寻找合适的突变位点,突设计含突变位点的引物,用ㄧPCR重叠延伸法对β防俣御素3成熟肽cDNA序刍列进行定点突变,将突变产⑺物克隆至pUC18进行序咎列测定及在中融合表达。结游果测序结果表明,经RTPCR所得的β防御素幂3成熟肽序列与GeneB帧ank中报道的编码人β泱防御素3成熟肽的cD
2、N哲A序列完全一致。经过突变甾β防御素3成熟肽第2蕨9位谷氨酰胺密码子由CA艄G突变为精氨酸密码子CG关A,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β防御素走3基因在中诱导表达3~5h后可见突变β防御素埃3蛋白表达。结论成功构槲建并表达了β防御素3笠突变体基因,为进一步对突雳变体进行真核表达、生物活ш性研究奠定了基础。【关键词】 人体β防御素抿3;定点突变;基因克隆;┩测序;基因表达Cons埃tructionande琳xpressionofa咤sitedirecte岈dmutantgeneo艹fhumanbetadefensin31
3、1/11AB骒STRACT Objecňtive Toextra欲ctthegeneenc秸odinghumanbe芷tadefensin蜗3(hBD3)from而humanforeski御ntissue,make坤asitedirect岽edmutagensis梃andexpressionwiththemuta叨ntgenein Met跞hods Thetota隋lRNAextractedfromhumanfo贶reskintissue嚆andthesequen髡ceofcDNAenco惧dinghBD3was赐amplifiedbyR菁TP
4、CR.Afters棋equencing,ap怄airofmutantp踬rimerswasdesねignedandsite舳directedmutㄨationwasmadebyoverlapex墉tensionPCRan爻dthenthemuta剃ntgenewasexp尬ressedin Res搓ults Sequencツinganalysisi捣ndicatedthat宴hBD3DNAobta骊inedbyRTPCR礁wasidentical颅tothesequenc琨ereportedinGъenBank.After姗mutation,the泐
5、codeCAGforgl蒎utaminewasch徊angedintothe犯codeCGAforar要ginineatposi涌tion29.After箫inductionfor3~5hours,ane鳜wprotEinband⑦appearedonSD涛SPAGEgel. C带onclusion Mu裟tanthBD3(mh袜BD3)geneisc膦onstructedan贰dexpressedin⒑BL21successfully.Itmight垦provideafoun蚓dationforconstructionofeukaryotice
6、xp讨ressionvectorandresearch髹ofitsbiologicalactivity.蕃KEYWORDS Humanbetadefeㄐnsin3; Site舄directedmutⅫagensis; Gen箕ecloning; Se桃quencing; Geneexpression抗菌肽是生物体产生的一类棚11/11抗微生物的阳离子小分子多颐肽,是生物天然免疫的重要禀组成部分[1]。由于这些缺物质对许多致病菌都有抗菌作用,而且无致畸作用,无平蓄积毒性,最为重要的是在糯机体内不易产生耐药性,因悭此有望开发为新型的抗生素尜,以解决
7、日益严重的传统抗帷生素耐药性问题。防御素(defensin)是近撑年来发现的一组富含半胱氨拦酸残基的抗菌肽,主要存在于上皮组织中,构成机体抵昭御病原微生物侵袭的第一道夼化学屏障[2]。人体β尉防御素3(humanb溉etadefensin龃3,hBD3)是新近逄被克隆出来的第三种人源性唑β防御素。它主要对革兰鲣阳性菌如金葡菌具有高效、剪广谱的杀伤作用,对盐离子巧浓度不敏感,在生理盐浓度哧范围内不易产生溶血现象[堑3],具有研究和应用价值仙。为了进一步研究hBD慵3的结构与其抗菌活性间的锇关系,我们应用PCR重叠鲣延伸法对hBD3成熟肽讳cD
8、NA的分子结构进行改莫造,得到突变体h
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