糖基转移酶2基因sild在大肠埃希菌中的克隆与表达论文

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1、糖基转移酶2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达论文洪文荣曾志红朱春宝陈代杰朱宝泉【摘要】从伊纽小单孢菌(Micromonosporainyoensis)扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD(1181bp)，并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa(43.04ku)的多肽链，在大肠埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD(来自M.echinospora)的碱基序列的同源性高达94%。预测的SilD蛋白序列与GntD的同源性为

2、98%。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srm1(AY661430)、西索米星2脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)和糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。【关键词】糖基转移酶2基因；伊纽小单孢菌；silD；克隆与表达ABSTRACTThegenesilD,anovelglycosyltransferase2gene,entcontainingsilD(1185bp)ge

3、ne(thekeygeneinvolvedinsisomicinbiosynthesis)MicromonosporainyoensisandclonedintopUC18vector.ItsORFisposedof1,173bp,encoding390aa(43.04ku).SequenceanalysisverifiedthatsilDgeneandaminoacidssequenceshoicinbiosynthesisfromM.echinospora),respectively.Thepredictionofstructureofsil

4、Dsuggesteditisalsoaglycosyltransferaseprotein.ThesilDexpressionvectorpETsilDid.ThesilDproteinonosporainyoensis.ThesilDisanovelgeneaftercloningthesisomicinresistancegenesrm1,glycosyltransferasegenesisZand2deoxyscylloinososesynthasegenesisBfromMicromonosporainyoensis.KEYicrom

5、onosporainyoensis;silD;Cloneandexpression放线菌中的小单孢菌属微生物能产生重要的氨基糖苷类抗生素，而氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物。伊纽小单孢菌(Micromonosporainyoensis)产生的西索米星及其相关的衍生物奈替米星被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素中不良反应最少、抗铜绿假单胞菌作用最强、抗钝化酶能力最广的抗生素，世界卫生组织(.inyoensis)TS388由福州大学提供；大肠埃希菌BL21(DE3)、大肠埃希菌DH5a和质粒pUC18均由上海来益生物药物研发中心提

6、供；表达载体为pET30a购自Novagen公司。其它常用化学药品及试剂购自上海生物工程公司和华美公司。1.1.2培养基LB培养基［12］根据需要添加氨苄西林(终浓度100mg/ml)和卡那霉素(终浓度50μg/ml)；用于伊纽小单孢菌TS388生长的培养基见文献［13］。1.1.3主要试剂所有工具酶购自TaKaRa公司；氨苄西林(ABPC)和卡那霉素为华美生物工程公司产品；琼脂糖为Pharmacia产品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司测定。1.2DNA操作和基因silD克隆及其测序伊纽小单孢菌TS388染色体D

7、NA的提取参照文献［13］；质粒DNA采用碱裂解法提取［12］，DNA酶切、连接等均按产品说明书进行；采用CaCl2方法制备感受态细胞，在含有抗生素的选择性培养基上筛选阳性转化子。DNA采用试剂盒回收(购自TaKaRa公司)。从GenBank中选择与伊纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)的庆大霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gntD作为引物设计的参考模板(AY524043)，设计一对简并引物，正向引物为：GAGAATTCATGGGCGGCATGCACGT(EcoRI)

8、；反向引物为：ACCTGCAGCGGTCATCTCAGGACTC(PstI)。PCR循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性1mi