tolc表达量与大肠埃希菌k

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1、TolC表达量与大肠埃希菌K作者：张丹凤黄传钟王三英【摘要】随着抗生素的开发与使用，细菌在对多种抗生素的适应过程中逐渐发展出对抗生素耐药的反应机制。TolC是药物排出转运体系的外膜成分，与AcrAB一起形成主要的药物排出泵，有关其表达量与耐药间的关系目前尚不清楚。试验将tolC克隆到pET-32a载体上进行诱导表达，镍柱纯化，免疫新西兰大白兔，获得1∶4000的抗血清。IC从100μg/ml提高到200μg/ml。结果说明TolC的表达量与四环素耐药性直接相关，提示细菌可以通过调节外膜蛋白的表达

2、实现对抗生素的耐受。【关键词】TolC；耐药性；大肠埃希菌K-12；四环素ABSTRACTAssociationofTolCexpressionembraneprotEin,acriticalmultidrugeffluxpump.HoountaryantibodyinALDI-TOF/MS鉴定按照Xu等［8］的方法进行样品处理，使用德国Bruker公司的ReFlexTMIIIMALDI-TOF质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N2激光波长337nm，脉

3、冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。1.5兔抗血清的制备根据Peng等［10］报道的方法免疫新西兰大白兔，采血，摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出，分装血清，－80℃保存。用DOT-ELISA方法测定血清的效价。1.6耐四环素大肠埃希菌K12的筛选按两倍稀释法［11］测定测定大肠埃希菌K12(原代，C0)对四环素的MIC值(MIC0)，然后在

4、次抑菌浓度条件下(0.5MIC)对大肠埃希菌进行传代培养，每隔12h传代1次，共传代10次，在MH培养基测定其(T10)的MIC值(MIC10)。如果MIC10/MIC0>4，则说明此菌株对该抗生素表现出耐药性。1.7膜蛋白提取按照Sabri等［12］的方法提取膜蛋白。挑取单菌落接种于培养基中，振荡培养过夜。以此为种子菌，按1∶50(V/V)的比例接种于另一批培养基中，振荡培养至A600=1.0，6000g收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次。称菌体湿重，按1∶5(in。超声破碎后的菌液，12

5、000g，4℃离心15min，收集上清。上清液100000g，4℃离心40min，弃上清，沉淀溶于一定体积超声缓冲液中。样品分装，－80℃保存。1.8IC值。2结果与分析2.1tolC克隆与载体构建以大肠埃希菌K-12全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，图1第2泳道示PCR扩增得到单一特异条带，而且片段的分子量大小与预计的相当。将tolC重组到pET-32a载体上，挑取重组克隆子，提取质粒并进行双酶切验证。结果表明，阳性克隆子酶切得到的目的片段与以大肠埃希菌K-12菌体作为模板的阳性1：分子量

6、标记；2：tolC的PCR产物；3～5：重组子双酶切验证图1tolCPCR产物与重组子双酶切验证对照大小一致(图1)。2.2TolC的原核表达与纯化图2A示pET-32a-tolC重组子经IPTG诱导表达后的全菌蛋白SDS/PAGE分析，可见pET-32a-tolC/BL21经诱导表达后，TolC蛋白加上融合蛋白大小约72.4ku左右，扣除20.2ku的载体融合蛋白，约为52.6ku左右，与预计的分子量相符。进一步用镍柱纯化重组TolC，结果如图2B所示。从图2可见，重组TolC为单一的目的蛋白

7、带，获得的目的蛋白较纯。切取目的蛋白带，采用MALDI-TOF进行鉴定。质谱结果如图3及表1所示，证明镍柱纯化的蛋白确为TolC。将其作为抗原，用于兔抗TolC抗血清的制备。结果表明，所制备的兔抗TolC抗血清的效价为1∶4000。2.3四环素耐药菌株膜蛋白提取与IC0值为6.25μg/ml，在次抑菌浓度条件下(1/2MIC)传代10次，测定其(T10)对四环素的MIC10值为25μg/ml，MIC10/MIC0为4倍，提示T10具有耐药性。分别提取了T10和C0两株菌的膜蛋白，Braford法

8、确定两者的上样量均为10μg，以兔抗TolC抗血清为一抗，HRP-羊抗兔为二抗进行IC值，结果如表2。从表2可见，tolC-pET-32a/BL21的MIC值为200μg/ml，pET-32a/BL21的MIC值为100μg/ml，前者是后者的2倍。3讨论抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的耐药菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，对细菌耐药机制的深入研究是解决这一难题的关键。现己经证实，细