大肠埃希氏菌.ppt

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1、大肠埃希氏菌药典法生化检查潘庆玲大肠埃希菌检查大肠埃希菌（Escherichiacoil）即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物粪便的污染，即可能是污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外，还有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为了保证人体健康，口服给药制剂必须检查大肠埃希菌。标准《中国药典》（2010年版）二部口服给药制剂细菌总数每1ml不得过100cfu霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cfu大肠埃希菌总数不得检出备料单（增菌培养）序号品名规格数量备注1锥形瓶25

2、0ml42刻度吸管10ml23刻度吸管1ml14烧杯250ml15量筒100ml16胆盐乳糖培养基100ml3装锥形瓶7pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液150ml1装锥形瓶灭菌参数：121℃、20min操作过程样品10ml90ml供试液稀释液阴样阳10ml10ml10ml菌悬液1mlBL培养基BL培养基BL培养基培养温度：36℃培养时间：18~24h（必要时可延长至48h）备料单（快速生化试验）序号品名规格数量备注1刻度吸管1ml32试管中43MUG培养基5ml4分装到试管中4靛基质————灭菌参数：115℃、20min操作过程阴样阳阴样阳本底靛基质试验紫外荧光0.2ml0.2ml0.2ml

3、培养温度：36±1℃培养时间：18~24h备料单（分离培养）序号品名规格数量备注1EMB或麦康凯琼脂培养基60ml1置皿2平皿——3灭菌参数：121℃、15min操作过程阴样阳EMB或麦康凯琼脂培养基接种环（四区划线法）培养温度：36±1℃培养时间：18~24h生化试验中MUG在紫外等下显荧光的原理大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸酶分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。BL培养基配方（每升）：胨20.0g提供碳氮源乳糖5.0g可发酵的糖类氯化钠5.0g维持均衡的渗透压磷酸氢二钾4.0g缓冲剂磷酸二氢钾1.3g去氧胆酸钠/牛

4、胆盐0.5g/2.0 g选择性抑菌剂使用方法1、称取本品35.8g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，每瓶100mL，121℃灭菌20min，待冷至常温后，备用。2、样品的处理。略。3、取胆盐乳糖增菌液3份，2份分别加入规定量的供试液，其中一份加入对照菌50～100个作阳性对照，第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。4、将三角瓶放入30～35℃恒温培养箱内培养18～24h。必要时可延长至48h。5、观察结果。阳性对照应生长良好，阴性对照应无菌生长。质量控制：本品质控菌株接种后，于36±1℃培养18～24h，培养结果肉汤呈混浊。MUG培养基配方（每升）：胰蛋白胨

5、20.0g提供碳氮源3号胆盐1.5g抑制革兰氏阳性菌乳糖5.0g可发酵的糖类磷酸氢二钾4.0g缓冲剂磷酸二氢钾1.5g氯化钠5.0g维持均衡的渗透压MUG0.05g使用方法1、称取本品37.05g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于带有小倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，待冷至常温，备用。2、将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG肉汤管中。3、将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.5±0.5℃培养24h±2h。如使用恒温水浴，在接种30min内进行培养，水浴箱

6、的液面应高于EC-MUG肉汤液面。4、观察结果：将培养基管置366nm紫外灯下约5cm处，以未接种培养物的EC-MUG培养基作空白对照，观察有无蓝白色荧光。空白对照管应无蓝白色荧光，试验管出现蓝白色荧光为阳性反应。质量控制：大肠埃希菌菌株接种后于36±1℃培养18~24h，结果产气，紫外灯下显荧光。EMB琼脂培养基配方（每升）：胨10.0g提供氮源、维生素、氨牛肉浸出粉3.0g基酸和碳源氯化钠5.0g维持均衡的渗透压乳糖10.0g可发酵的糖类琼脂14.0g培养基凝固剂曙红钠0.4g抑菌剂（革兰氏阳性菌）亚甲蓝0.065gpH指示剂在酸性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的

7、菌落。使用方法1、称取本品42.5g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。2、待培养基冷至50℃左右，以无菌手续，倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。3、将供试液划线接种于平板上。4、将平板翻转，放入恒温培养箱中，30～35℃培养18～24h。5、观察结果。质量控制：本培养基倾注平皿待冷却后呈紫色，可有细微沉淀。大肠埃希菌菌株接种后。36±1℃培养