大肠埃希菌检查(新)

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1、实训一大肠埃希菌的检查一、实训目标1.熟悉纱品中大肠埃希菌的检验原理。。2.掌握由口服药品中分离鉴定人肠埃希菌的程序及步骤。3.学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。4.掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。二、实训原理大肠埃希菌是肠道中存在的止常菌群，故常來源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出人肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。I大I此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。中国一药典采用了MUG—Indole快速测定约品中大肠埃希菌

2、。在MUG试验中，将MUG（4-甲基金形酮葡糖昔酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的B-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366nm紫外光下呈现兰口色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即ME阴性。靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白淼中的色氨酸，生成口引卩朵。网味的存在可用显色反应表现出来。眄I味与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰卿味，为红色化合物。因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者（阳性），报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的

3、培养和生化试验检查。本方法对大肠埃希菌的检岀率达98%。培养温度：控制菌培养温度为30〜35°C。三、实训步骤（-）实训用设备、仪器与试药的准备100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白月东、l.Omol/lUCl溶液＞l.Omol/lNaOH溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸稀释液与培养基的配制1）PH7.0氯化钠-蛋白腺缓冲液（200ml/2组）磷酸二氢钾0・7g磷酸氢二钠l・5g氯化钠0.9g蛋口豚0.2g蒸憾水20

4、0ml个，包扎，标记,12T,乳糖胆盐培养基2）乳糖胆盐培养基配制：称取，溶解,100ml/个，包扎，标记,配制：取上述成分混合，溶解，分製锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/15min灭菌。（400ml/2组）12g蒸憾水400mlPH二7.6调节PII值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约1151,15min灭菌（-）实验用仪器的包扎（以组为单位）lml吸量管2支、50ml烧杯1个、10ml吸量管2支（（三）大肠埃希菌检查法——常规平板法检查1、供试液的稀释用吸量管吸取葡萄糖酸钙口服药液10ml,到装冇90mlpH7.0氯化钠-蛋白腺缓冲液的锥形瓶中，混匀，得到1：10的

5、供试液。2、阳性对照试验取1：10供试液10ml和lml含菌量10〜lOOcfu的人肠埃希菌菌悬液加入增菌培养基，按大肠埃希菌检查法检查，作为阳性对照，应为MUG阳性、靛基质阳性,检出大肠埃希菌。3＞增菌培养取］:10供试液10ml（相当于供试品lg）接种于BL增菌培养基，培养18〜24小时。4、MUG培养各取上述培养物0.2ml,分别接种到两支5mlMUG培养基的试管内，培养,于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。然后沿管壁加靛基质试液数滴观察。5、分离培养（教师做阳性板给学生看大肠埃希菌的菌落形态）用接种环沾取需进一步检杳的培养物划线接种于EM

6、B平板上，培养18〜24h。检查冇无疑似大肠埃希菌菌落，若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验。6、结果分析1）MUG、靛基质结果判断MUG培养结果：在366nni紫外线卜•观察靛基质结果：液而呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌；MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，需进一步做以下检查2）EMB培养结果判断EMB培养18-24h后，检查冇无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形态特征人肠埃希菌菌

7、落形态特征培养基菌落形态EMB呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽3）结果记录30〜35°C培养项目供试品阳性对照MUG靛基质结果：□未检出/g(ml)□检岀/g(ml)—规定:口服制剂细菌数lg不得超过1000个；lml不■得超过100个。霉菌及酵母菌数lg木得艙过100个。控制菌lg(lml)木得恵也去肠埃希菌。结论：本品