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1、大肠埃希菌检查法EscherichiaColiTestMethod1•目的2•范围适用于大肠埃希菌检查的操作。3.责任者QC化验员。4.程序：4丄简述4.1.1.大肠埃希菌(Escherichiacoli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱竣埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为
2、保证人体健康，口服药品必须检查人肠埃希菌。4.1.2・用4■甲基伞形酮葡糖甘酸件Methylumbellifery"・D-glucuronide,MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG・蛋白腺培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定冃标菌。实验证明，96%的大肠埃希菌含B■葡糖甘酸酶(B-glucuronidas
3、e,GUD),约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌英靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。
4、如仅用IMViC牛化试验来鉴别人肠埃希菌属中的人肠埃希菌，其结果是含混的。42仪器、设备及用具4.2.1.无菌室4.2.2.净化工作台4.2.3.培养箱(36±1°C)4.2.4.高压蒸汽灭菌器4.2.5.显微镜(1500X)4.26微波炉4.2.7.恒温水浴(45土1°C)4.2.8.离心机(500~4000r/min)4.2.10・电冰箱4.2.11.匀浆仪4.2.12.366nm紫外灯4.2.13・玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1.0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g,加水使溶解成1000ml,121°C
5、灭菌20分钟。4.3.2.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛l.Og,加入95%乙醇95ml,充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。4.3.3.甲基红指示液取甲基红0・2g,加95%乙醇300ml,使溶解后加水至500ml,即得。4.3.4.V-P试液「荼酚乙醇试液：取a—荼酚6.0g,加无水乙醇溶解使成100mlo氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g>加水使溶解成100m
6、lo4.3.5.革兰染色液43.5.1.结晶紫染液取结晶紫1.0g>95%乙醇20ml、1%草酸镀[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸镂混合，静置48h,置密闭棕色瓶，可存放数月。4352革兰碘液碘l.Og、碘化钾2.0g、蒸憾水300mlo用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸惚水至30ml,置棕色瓶备用。43.5.3.脱色液95%乙醇43.5.4・沙黄（番红）染液沙黄（SafranineO）0.25g>95%乙醇10ml>蒸馆水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至lOOmL4.3.1.
7、亚甲蓝指示液取亚甲蓝0・5g,加水溶解使成100mlo4.3.2.漠麝香草酚蓝指示液取漠麝香草酚蓝0.4g,加lmol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100mlo变色范围pH6.0〜7.6（黄一红）4.3.3.酸性品红指示液取酸性品红0.5g,加水100ml溶解，再逐渐加lmol/L氢氧化钠溶液16ml,每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0~7・4（黄一红）。4.3.4.曙红钠指示液取曙红钠2.0g,加水溶解使成100mlo4
8、.3.5.无菌聚山梨酯80•氯化钠溶液取聚山梨酯80lml加0.9%氯化钠溶液使成100ml,121°C灭菌20分钟。4.3.6.无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g,加水稀释至1000ml,121°C灭菌20分钟。4.3.12・无菌对氨基苯甲酸试液取对
