人防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定精品论文.doc

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1、人8防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定—作者：小小小作者：曹玉红，张光运，张国成【摘要】目的：构建人3防御素4(human(3defensin4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX4T2/mHBD4,诱导GSTHBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达，并制备其多克隆抗体。方法：从重组克隆载体PMD18T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因，并克隆入PGEX4T2中，在IPTG诱导下，表达GSTHBD4融合蛋白。以表达的融合蛋白GSTHBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GSTHBD4的抗血清，抗体效价及特异性分别用ELISA和Westernblot法鉴定。结果：在

2、大肠杆菌中成功表达血约为32000的融合蛋白GSTHBD4OELISA法检测抗血清的效价可达到1：128000,Westernblot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GSTHBD4特异结合。结论：在大肠杆菌中成功表达了GSTHBD4融合蛋白，并制备了GSTHBD4的抗血清，为进一步研究IIBD4蛋白的结构和功能奠定了基础。【关键词】人P防御素4基因克隆融合表达[Abstract]AIM:Toconstructtheprokaryoticfusionexpressionvectorofhuman3defensin4(HBD4),andtoexpressGSTHBD4fusionpr

3、oteininEscherichiacoli(E.coli)andpreparepolyclonalantibodyofGSTIIBD4.METHODS:ThegeneencodingmaturepeptideofHBD4(mHBD4)wasamplifiedbyPCRfromcloningvectorPMD18T/HBD4whichcontainedthefulllengthHBD4cDNAandthenclonedintoprokaryoticexpressionvectorPGEX4T2toconstructPGEX4T2/mHBD4.GSTHBD4expressionwa

4、sinducedbyIPTG.TheantiserumwaspreparedbyimmunizingrabbitwithGSTHBD4.ThetiterandspecificityoftheantibodyweredetectedbyELISAandWesternblot,respectively.RESULTS:TherecombinantexpressionvectorPGEX4T2/mIIBD4wassuccessful1yconstructed.AfterbeingiinducedbyTPTG,Thefusionproteinwithrelativemolecularma

5、ssof32000wassuccessfullyexpressedinE.coliandpartlyexpressedinthesolubleforminsupernatant.TherabbitantibodyagainstGSTHBD4wasobtained.TheELISAtiterofantiserumagainstGSTHBD4wasabout1:128000.WesternblotanalysisshowedthattheantiserumcouldbindtotheexpressedGSTHBD4specifically.CONCLUSION:Therabbitan

6、tibodyagainstGSTHBD4hasbeensuccessfullyprepared,whichlaysthefoundationforfurtherstudyingthestructureandfunctionofHBD4.[Keywords]humanPdefensin4;genecloning;fusionexpression防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽。哺乳动物防御素可分为a、P两类。a防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生，而P防御素广泛表达于多种器官的上皮和黏膜细胞，在使机体免受外界微生物侵袭中有着重要的作用。人类3防御素(human(3

7、defensin,HBD)有4种亚型(HBD1-4),具有杀伤细菌、真菌、病毒、原虫及肿瘤以及免疫调节等多重活性，而且不产生细菌耐药性，因此成为国内外众多学者研究的热点［1-3］o国外研究表明，HBD4对多种病原菌有杀灭作用［4］。然而生物体内天然的HBD4含量很低，分离纯化难度大，化学合成成本高。因此利用基因工程技术获得大量HBD4成为必然。目前关于HBD4的体外表达及抗体制备等的相关研究，国内尚未见报道，国外研究亦非常少。我们在己获得编码此蛋白的全长216bp的基因序列并构建