人α防御素的稳定表达和活性鉴定

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1、人α防御素的稳定表达和活性鉴定刘娟　翟嵩　杜德伟　王临旭　王少扬　汪定成　孙永涛【关键词】人α防御素　　Expressionandfunctionalcharacterizationofhumanαdefensins　　【Abstract】AIM:Topreparesecretaryhumanαdefensin1andαdefensin3andtodeterminethefunctionalcharacterizationoftheirantimicrobialactivities.METHOD

2、S:EukaryoticexpressionvectorpcDNA31/V5HisTOPOHNP1andpcDNA3.1/V5HisTOPOHNP3idpDCH1P11(carryingdhfrgene)intoCHOdhfr-cellsrespectivelyandtherebinantproteinediumcontainingG418andthenseriallypassagedinmethotraxate(MTX)forgeneamplification.Theexpressions18

3、85~4746mg/L・48hper106cells,g/L・48h.303bpsegmentsplifiedfromstablytranfectantclonesandstrongfluorescenceaaroundthenuclearinthestablytransfectantcellsbyIFA.KBdiscagardiffusiontestfoundobviousbacteriastaticdiffusiononMHplateofE.coli.CONCLUSION:Humanαdef

4、ensin1andαdefensin3areeffectivelysecreted,icrobialactivities.OurresultslaythebasisforthedevelopmentofantiHIV1activitybyrebinantαdefensin1and3.　　【Keyanαdefensin;CHOdhfr;methotrexate　　【摘要】目的：制备有较高生物学活性的分泌型人α防御素1与α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性；方法：将真核表达质粒pcDNA31/V5His

5、TOPOHNP1,3与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHOdhfr，ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤（MTX）加压扩增,ELISA法、RTPCR法及间接免疫荧光（IFA）分析蛋白表达情况，并同步测定其体外抗菌活性.结果：α防御素1的表达量是1885~4746mg/L・48h・106个细胞；α防御素3的表达量是1689~3557mg/L・48h・106个细胞.用RTPCR从稳定表达的细胞株中扩增出

6、全长约303bp的片段；IFA显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光；KB纸片琼脂扩散法显示α防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论：成功高效地表达了分泌型的α防御素1,3，并具有良好的生物学活性，为进一步探讨α防御素1,3对HIV1的抑制作用提供了物质基础.　　【关键词】人α防御素；CHOdhfr细胞；甲氨喋呤　　0引言　　防御素是在中性粒细胞和上皮细胞中发现的一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽.根据6个半胱氨酸残基的位置及二硫键连接的不同，将哺乳动物的防御素分为3类：

7、α防御素、β防御素和环状防御素，它们具有强大而广谱的抗菌活性.人中性粒细胞中含有的α防御素又名人中性粒细胞多肽14（humanneutrophilpeptide14，HNP14）等，它们在中性粒细胞分化成熟前已合成，在生理情况下不能被诱导表达〔1〕.晚近又发现：人α防御素13有抗HIV的作用〔2，3〕.然而，人体中的防御素含量很少、结构相似，通过分离提纯获得生物活性较高的防御素单组分还存在一定的技术难度，化学合成又成本太高.基因工程技术可以帮助人类获得特定的大量人类蛋白质，是获取目的蛋白的一个有

8、效手段.因此，本课题将真核表达载体pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3在CHOdhfr系统中进行基因扩增表达，获得了大量分泌型的防御素，为基因工程生产防御素提供了可能的生产模式，也为进一步研究人α防御素1-3与HIV1的作用环节奠定了基础.　　1材料和方法　　11材料CHOdhfr由军事医学院基础研究所沈倍奋教授惠赠；真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1，3由本室构建；大肠埃希菌标准质控菌株为ATCC25922；含dhfr基因片段的质粒pDCH1P11由美国哥伦比亚大