人α防御素的稳定表达和活性鉴定【精品论文】

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1、人a防御素的稳定表达和活性鉴定—作者：小小小作者：刘娟翟嵩杜德伟王临旭王少扬汪定成孙永涛【关键词】人a防御素Expressionandfunctionalcharacterizationofhumanadefensins【Abstract]ATM:Topreparesecretaryhumanadefensin1andadefensin3andtodeterminethefunctionalcharacterizationoftheirontimicrobialactivities.METHODS:Eukaryotic

2、cxprcssionvectorpcDNA31/V5IIisT0P0IINPlandpcDNA3.l/V5IIisT0P0IINP3worecotransfectedwithplasmidpDCHlPll(carryingdhfrgene)intoCHOdhfr-cellsrespectivelyandtherecombinantproteinwasverifiedbyELISA.ThestableexpressioncellstrainswerescreenedbyselectivemediumcontainingG

3、418andthenseriallypassagedinmethotraxate(MTX)forgeneamplification.TheexpressionswereanalyzedbyELISA,RT-PCRandIFA,andthebeicteriastaticactivitieswereassayedinvitro.RESULTS:Thecxprcssionlevelofadefensinlrangedfrom1885~4746mg/L・48hper106cells,whilethatofadefensin3w

4、as1689"3557mg/L•48h.303bpsegmentswereamplifiedfromstablytranfectantclonesandstrongfluorescencewasvisibleincellplasmaaroundthenuclearinthestablytransfectantcellsbyIFA.KBdiscagardiffusiontestfoundobviousbacteriastaticdiffusiononMHplateofE.coli.CONCLUSION:Humanadef

5、ensin1andadefensin3areeffectivelysecreted,whichareofhighantimicrobialactivities.OurresultslaythebasisforthedcvclopmcntofantiHIVlactivitybyrccombineintadefensin1eind3•【Keywords]humanadefensin;CHOdhfr;methotrexate【摘要】目的：制备有较高生物学活性的分泌型人a防御素1与a防御素3,并初步鉴定其抗菌活性；方法：将真核

6、表达质粒pcDNA31/V5HisT0P0HNPl,3与含有dhfr基因的质粒pDCHlPll共转染入CHOdhfr,ELTSA检测到培养上清中重组蛋白的表达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋吟(MTX)加压扩壇，ELISA法、RTPCR法及间接免疫荧光(IFA)分析蛋口表达情况，并同步测定其体外抗菌活性•结果：«防御素1的表达量是1885~4746mg/L・48h-106个细胞；a防御素3的表达量是1689^3557mg/L・48h・106个细胞•用RTPCR从稳定表达的细胞

7、株中扩增出全K约303bp的片段；IFA显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光；KB纸片琼脂扩散法显示a防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论：成功高效地表达了分泌型的a防御素1,3,并具冇良好的生物学活性，为进一步探讨a防御素1,3对H1V1的抑制作用捉供了物质基础.【关键词】人a防御素；CHOdhfr细胞；甲氨喋吟0引言防御素是在中性粒细胞和上皮细胞中发现的一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽•根据6个半胱氨酸残基的位置及二硫键连接的不同，将哺乳动物的防御素分为3类：a防御素、B防御素和坏状防

8、御素，它们具有强大而广谱的抗菌活性•人中性粒细胞中含有的a防御素又名人中性粒细胞多肽14(humanneutrophilpeptidel4,HNP14)等，它们在中性粒细胞分化成熟前已合成,在生理情况下不能被诱导表达[1]・晚近又发现：人o防御素13冇抗H1V的作用[2,3]•然而，人体中的防御素含量很少、结构相似，通过分离提纯获