驯鹿β防御素1(rebd1)基因的原核表达与蛋白活性的鉴定

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1、摘要防御素（defensin）是生物体先天性免疫系统中的一类短肽，是内源性抗菌肽中的一个大家族。防御素具有广谱的抗菌活性，无论在细胞内或细胞外都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物，维持机体内环境的稳定，同时对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用。β-防御素是防御素家族的重要成员之一，本文对驯鹿β-防御素的表达、分离纯化及抗菌活性等方面展开了初步研究。本试验旨在构建驯鹿β防御素-1（reindeerβ-defensin-1，reBD-1）基因的原核表达载体pET-32a（+）/reBD-1，诱导reBD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达，并对其表达产物的生物学活

2、性进行评价。利用RT-PCR技术扩增出编码reBD-1前原肽基因。从重组克隆载体pMD-19T/reBD-1中扩增reBD-1成熟肽编码序列，并克隆入pET-32a（+）中，在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达reBD-1融合蛋白。表达的融合蛋白扩大培养，进一步纯化后进行体外抑菌实验。结果表明，编码reBD-1前原肽和成熟肽的基因序列大小分别为225bp和138bp，目的基因的序列与reBD-1mRNA序列同源性为100﹪。前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分别为28KDa和24KDa。利用琼脂糖扩散法表明0.08mg/ml的纯化成熟肽蛋白对金黄

3、色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用。结果显示，reBD-1前原肽及成熟肽的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。成熟肽融合蛋白对革兰氏阳性菌、阴性菌的活性有抗性，前原肽融合蛋白没有抗菌活性。关键词：驯鹿；防御素；基因克隆；蛋白表达；抗菌活性ProkaryoticexpressionofReindeerβ-defensin-1(reBD-1)geneandbioactivityevaluationAbstractDefensinsaresmallpeptidesoftheinnateimmunesystemoforganism.Defensinsar

4、eabigfamilyamongendogenousantimicrobialpeptides.Thepeptideshaveantimicrobialactivityagainstabroadspectrumofmicrobes.Nomatterintheintracellularorextracellularcompartment,theywillkillbacterium,eumycete,virusandsomemalignanttumorcells.β-defensinsareanimportantmemberofdefensins.Inth

5、isstudy,westudytheexpression,isolation,purificationandantibacterialactivityofβ-defensinfromreindeer.Theaimofthisexperimentistoconstructprokaryoticexpressionvectorofreindeerβ-defensin-1(reBD-1),inducetheexpressionofreBD-1fusionproteininE.coli,andevaluatethebioactivityoftheexpress

6、ionproducts.Thesequenceofencodingprepro-peptideofreBD-1wasamplifiedbyRT-PCR.ThesequenceofencodingreBD-1maturepeptidewasamplifiedfromrecombinantcloningvectorpMD-19T/reBD-1,andthenclonedintopET-32a(+),duringwhichreBD-1fusionproteinexpressionwasinducedbyIPTGinE.coliBL21(DE3).Theexp

7、ressedproductwasfurtherculturedandpurifiedforexperimentofbacteriostasisinvitro.Theresultsshowedthattheamplifiedproductsofencodingprepro-peptideandmaturepeptidewere225bpand138bprespectively,andthehomologyofthesequencesofthetargetedgeneandreBD-1mRNAwasupto100%.Thefusionproteinsmol

8、ecularweightofprepro-peptideandmaturepeptidewer