简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

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1、简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定【摘要】　　目的:构建人β防御素4（humanβdefensin4,HBD4）基因的原核融合表达载体PGEX4T2/mHBD4,诱导GSTHBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体。方法:从重组克隆载体PMD18T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX4T2中,在IPTG诱导下,表达GSTHBD4融合蛋白。以表达的融合蛋白GSTHBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GSTHBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和r约为32000的融合蛋

2、白GSTHBD4。ELISA法检测抗血清的效价可达到1∶128000,:Toconstructtheprokaryoticfusionexpressionvectorofhumanβdefensin4（HBD4）,andtoexpressGSTHBD4fusionprotEininEscherichiacoli（E.coli）andpreparepolyclonalantibodyofGSTHBD4.METHODS:ThegeneencodingmaturepeptideofHBD4（mHBD4）plifiedbyPCRfromcloning

3、vectorPMD18T/HBD4HBD4.GSTHBD4expressionmunizingrabbitHBD4olecularmassof32000insupernatant.TherabbitantibodyagainstGSTHBD4againstGSTHBD4couldbindtotheexpressedGSTHBD4specifically.CONCLUSION:TherabbitantibodyagainstGSTHBD4hasbeensuccessfullyprepared,anβdefensin4;geneclonin

4、g;fusionexpression　　防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽。哺乳动物防御素可分为α、β两类。α防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生,而β防御素广泛表达于多种器官的上皮和黏膜细胞,在使机体免受外界微生物侵袭中有着重要的作用。人类β防御素（humanβdefensin,HBD）有4种亚型(HBD1～4),具有杀伤细菌、真菌、病毒、原虫及肿瘤以及免疫调节等多重活性,而且不产生细菌耐药性,因此成为国内外众多学者研究的热点[1-3]。国外研究表明,HBD4对多种病原菌有杀灭作用[4]。然而生物体内天然的HBD4含量很低,分

5、离纯化难度大,化学合成成本高。因此利用基因工程技术获得大量HBD4成为必然。目前关于HBD4的体外表达及抗体制备等的相关研究,国内尚未见报道,国外研究亦非常少。我们在已获得编码此蛋白的全长216bp的基因序列并构建了克隆载体PMD18T/HBD4的基础上,旨在构建HBD4原核表达载体,在大肠杆菌中大量表达HBD4融合蛋白,并制备其多克隆抗体,为进一步研究此蛋白的结构和功能奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料rTaq酶、4×dNTP、限制性内切酶BamHI、EcoRI、T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司;含全长HBD4cDNA的重组克

6、隆载体PMD18T/HBD4由第四军医大学西京医院儿科实验室构建。质粒PGEX4T2、大肠杆菌DH5α由第四军医大学生物化学与分子生物学实验室惠赠,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DAB显色试剂盒购自天为时代公司。基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成,并经PAGE纯化。HRP标记的羊抗兔IgG购自华美公司。家兔由本校实验动物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1HBD4成熟肽编码基因(mHBD4cDNA)的获得根据GenBank报道的HBD4成熟肽编码基因序列,设计2条引物,以重组

7、克隆载体PMD18T/HBD4为模板,进行PCR反应。设计上游引物D1:5′CGGGATCCGAATTTGAATTGGACAGAATATGTGG3′及下游引物D2:5′CGGAATTCTCAGGGTTTTGTACGATTCAGTAA3′,其两端分别设计有EcoRI和BamHI酶切位点并引入2个保护碱基,依次加入载体PMD18T/HBD41μL作为模板,上下游引物各1μL,10×PCR缓冲液5μL,4×dNTPs4μL,rTaqDNA聚合酶0.2μL,去离子水补充反应体积至50μL,进行PCR反应:94℃3min;94℃30s,55℃3

8、0s,72℃30s,35循环;72℃5min,产物在20g/L琼脂糖凝胶上电泳。　　1.2.2原核表达载体PGEX4T