人erβ af1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备

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1、人ERβAF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备：袁斌,仇玮祎△,李杰之,丁丽华,韩聚强,熊志红,杨智洪,叶棋浓【摘要】　　目的:制备雌激素受体β多克隆抗体。方法:从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβAF1结构域（1～144位氨基酸）,DNA重组插入原核表达质粒pGEXKG,转化大肠杆菌DH5α,异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GSTERβAF1融合蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠,制备鼠多抗血清。通过r)约为60000,其一级结构由N端到C端,可分为A/B区(转录调控区)、C区(DNA结合区)、D区(多变铰链区)、E/F区(

2、配体结合区)等6个功能区[4]。ERβ与ERα相比肽链较短,但其氨基酸序列在DNA结合区和配体结合区与ERα有高度同源性,分别达96%和60%,在活性功能区AF1和AF2同源性很低[5]。在分子水平上,ERβ通过经典的ERE途径、AP1和Sp1位点等[6],与内源性配体（如雌激素）或其他配体（如抗雌激素和植物雌激素）发生反应,进而调节一系列靶基因,调控靶组织（器官）某些正常生理功能的发挥（如维持骨密度,生殖器官的发育）和某些肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌）的发生、发展过程。由于多种肿瘤中都有ERβ的表达,且共表达水平降低,因此ERβ极有可能成

3、为一种新型肿瘤分子标记,有助于临床肿瘤的早期诊断。由于ERβ在正常生理及病理过程中均起到重要作用,因此对ERβ功能的深入研究具有十分重要的意义。　　1材料和方法　　1.1材料克隆载体pGEXKG、pcDNA3FLAGERβ重组质粒、E.coliDH5α均为本实验室保存。抗FLAG的单克隆抗体(mAb)均购自Sigma公司;辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗鼠IgG购自Vector公司;SP试剂盒购自北京中山公司;限制性内切酶BamHI和XhoI购自NEB公司;高保真pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶及IPTG购自Promega公司;质粒提

4、取试剂盒(包括小量提取、大量制备2种)购自Qiagen公司;DNA胶回收试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Promega公司。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒的构建以乳腺cDNA文库(Clontech)为模板,以P1(5′CGGGATCCATGGATATAAAAAACTCACCA3′)和P2(5′CCGCTCGAGCTACCTCTTTGAACCTGGACC3′)为引物,PCR扩增编码1～144位氨基酸的ER片段。以BamHI和XhoI双酶切PCR产物,将PCR产物插入到同样双酶切的pGEXKG载体中,即得重组质粒pGSTERβ(1～

5、144位氨基酸,aa)。上述克隆所用PCR扩增条件为:94℃变性3min后,按以下参数进行30次循环:94℃变性30s,58℃复性30s,72℃延伸1min。最后72℃延伸7min。PCR扩增所用酶为pfuDNA聚合酶。重组质粒经载体上的通用引物测序。　　1.2.2GST融合蛋白的诱导表达及纯化将上述构建的表达GST的融合蛋白的重组质粒和表达GST的空载体pGEXKG转化到E.coliDH5α中。转化于37℃振荡过夜,再按2%的接种量转接,30℃培养6h后,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,20℃继续诱导培养过夜。收集上述诱导菌,用谷胱

6、甘肽Sepharose4B小颗粒纯化GST融合蛋白,基本按Pharmacia公司提供的方法进行,即按10∶1(V/V)的比例加入细胞裂解液(50mmol/LTrisHClpH7.5、150mmol/LNaCl、1mmol/LEDTA、0.3mmol/LDTT、1g/LNP40及蛋白酶抑制剂),超声破碎,离心收集上清液,加入适量谷胱甘肽Sepharose4B小颗粒,结合3h。再收集谷胱甘肽Sepharose4B小颗粒,用细胞裂解液充分洗去未结合蛋白质后,即得到结合有GSTERβ(1～144位氨基酸)融合蛋白或GST蛋白的谷胱甘肽Sep

7、harose4B小颗粒。　　1.2.3多克隆抗体的制备将纯化的GSTERβ(1～144aa)融合蛋白与福氏完全佐剂1∶1混匀后,皮下多点注射BALB/c小鼠,初次免疫后每3周使用不完全弗氏佐剂加强免疫1次,末次免疫后第10天眼球取血,免疫血清于-70℃保存[7]。　　1.2.4哺乳动物细胞的转染用无双抗的DMEM培养基(含100mL/LFBS)将293T细胞接种在12孔板中。接种后24h,将总量为2.0μgDNA与80μLDMEM培养基混合,再将2.5μLLipofectamine2000与80μLDMEM培养基混合,然后将上述2种溶液混合,室

8、温放置15min,加入到细胞中。　　1.2.5CF7、MDMBA435、ZR751、MDMBA231、MDMBA453和T