人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定

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1、人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定【关键词】免疫血清ExpressionofhumanlrginE・coliandidentificationofimmuneserumagainsthumanLrgproteinDUKejun,CHAIYuBo,CHANGWenHui,HOULiChao,ZHANGXiaoNan,CHENNanChun,LINShuXin,CHENSuMinDepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,SchoolofBasicMedicine,FourthMilitaryMedicalUniversit

2、y,Xian710033,China[Abstract]AIM:ToexpresshumanlrginE・coliandtoobtainananti-Lrgimmuneserum・METHODS:lrgcDNAwasclonedintopcTATvector.ThefusionproteinswereexpressedinE・coliandpurifiedbyNi-NTAcolumnandSDS-PAGE・RabbitswereimmunizedwithpreliminarypurifiedLrgproteinandreinforcedthreetimes・Theantiserum

3、wascollected・RESULTS:AntiserumagainstLrgwasobtainedinimmunizedrabbitsanditstiterwasmorethan1:1000provenbyELISAandWesternBlot.ThepurifiedLrgproteincouldgetacrossmembranesofPapillaDentalCellswithin30min.ImmimohistochemicaltestwiththisantiserumshowedthatLrgwasacytoplasmicproteinandrabbitantiserum

4、againsthumanLrgproteincouldbeusedineukaryoticcellandnonnaltissues・CONCLUSION:TheimmuneserumspecificagainstLrgisobtained,whichcanbeusedinnormaltissuesandcells・[Keywords]lrg;affinitypurification;immunesera【摘要】目的：在大肠杆菌表达人lrg,制备鉴定人Lrg免疫血清.方法：构建pcTATlrg重组表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋口；对表达的融合蛋白采用鎳柱和SDSPAGE

5、纯化；以纯化蛋口作为免疫抗原，对新西兰白兔实施多次免疫（间隔时间分别为1mo,3wk,2wk）.结果：获得兔抗人Lrg免疫血清.经过ELISA和WesternBlot检测，效价在1:1000以上真核细胞实验表明，6HisTATLrg蛋白具有良好的穿透性，可以在30min内从培养液进入细胞质；免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白；兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测.结论：制备得到兔抗人Lrg免疫血清，为lrg的功能研究打下基础.【关键词】人lrg基因；亲和纯化；免疫血清0引言人lrg基因是一种脂多糖应答基因.系采用基于PCR的改良消减杂交技术［1］，用脂多糖刺激人牙髓细

6、胞，克隆得到并登陆GenBank的新基因［2,3］,具体功能还不清范.生物信息学分析表明，人lrg基因的开放读框约558bp,预计编码的蛋白质包含186个氨基酸；编码的序列中包含2个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1个螺旋-转角-螺旋结构［3］,而亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征性结构.因此，对人lrg基因的研究既有线索可寻，又可以采用一些较新的方法［4］，来加快研究进度.而深入研究Lrg在体内组织细胞分布特点及其功能，需要高效价的Lrg抗体.为此，我们在大肠杆菌中融合表达了人Lrg蛋白，并对6HisTATLrg初步纯化.用纯化后的蛋白，免疫新西兰大白兔,以获得高效价的抗Lrg血清.

7、1材料和方法1.1材料重组质粒pUC191rg由本室构建［3］:BL2KDE3）菌种和pcTAT载体由本室保存.DNAmarkerDL2000购于TaKaLa公司.PCR引物由上海博雅公司合成.成年雄性新西兰大白兔1只（1.2kg）由第四军医大学实验动物中心提供.HRP标记的羊抗兔二抗购自SantaCruzBiotechnology;DAB,NBT/BCIP由Sigma公司提供.SABCFITC、免疫组化检测试剂盒由武汉博士德公司提供.1・2方法1.2.1人lrg的扩