人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定论文

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1、人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定论文杜可军，柴玉波，常文辉，侯理朝，张晓楠，陈南春，林树新，陈苏民【关键词】免疫血清【Abstract】AIM:ToexpresshumanlrginE.coliandtoobtainananti-Lrgimmuneserum.METHODS:lrgcDNAnandSDS-PAGE.RabbitsmunizedinarypurifiedLrgproteinandreinforcedthreetimes.TheantiserumagainstLrgmunizedrabb

2、itsanditstiterorethan1∶1000provenbyELISAandr为25×103,占菌体蛋白总量的42%（Fig3）.经Ni柱纯化上清蛋白后,该目的蛋白占菌体蛋白总量的46%（Fig3）.将Ni柱纯化后的蛋白进行SDSPAGE二次纯化（Fig4），切下相应的目的蛋白条带，生理盐水溶解，免疫新西兰白兔.2.4ELISA检测免疫血清的效价酶标仪测量A280nm值(平均数)为:空白孔0.035,1∶1000抗体孔0.177.二者之比大于5，参考试剂盒规定，表明免疫新西兰大白兔所产生的免疫血清效价在1∶100

3、0以上.2.5r为25×103)的特异性条带(Fig5),同时未免疫兔血清没有表达相应的蛋白条带.2.6SABCFITC染色检测免疫血清效果与对照组(Fig6A)相比，加入6HisTATLrg融合蛋白的牙乳头细胞在胞质内呈现明显的绿色荧光(Fig6B).表明6HisTATLrg融合蛋白在30min内进入细胞，而本实验制备的免疫血清可有效应用于真核细胞的检测.2.7免疫组化进行免疫血清的检测加未免疫兔血清的睾丸间质细胞胞质呈蓝色(Fig7A)；加兔抗人Lrg免疫血清的睾丸间质细胞胞质内有棕黄色免疫反应阳性颗粒(Fig7B).

4、说明Lrg蛋白位于正常睾丸组织睾丸间质细胞的胞质内.3讨论近年来内毒素血症的研究在危重医学领域中十分活跃，对其发病机制的认识也在不断深入.脂多糖（LPS）是一种内毒素，大量实验表明，LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖受体系统(CD14)参与了炎症反应的病理生理过程［7］.LPS在细胞表面以LPSLBPCD14三体复合物的形式活化TLR4信号传导途径，通过一系列胞内分子的相互作用，产生炎性因子（如IL1，TNF等），导致炎症反应，甚至出现DIC和MOD［8］.LPS是机体炎症反应的重要触发剂，因此，探讨LPS刺激后应答

5、基因的功能，尤其是新发现基因的功能，研究其在LPS信号传导途径中的作用部位和作用性质，有助于阐明炎症发生的分子机制.我们课题组自从成功克隆lrg基因并登录GenBank［1,3］以来，对该基因的功能展开了初步研究.生物信息学分析表明，lrg基因编码的蛋白可能是一种DNA结合蛋白.本课题组的前期实验表明，lrg基因作为一种LPS应答基因，会对真核细胞的细胞周期发生一定影响（资料待发表）.尽管实验取得了一定进展，但该基因更多功能尚有待阐明.利用课题组设计的引物，PCR得到了长1000bp的产物，与预期大小相符.该片段不仅包括了

6、lrg基因的编码区，也包括了lrg基因下游的非编码区序列.为了进一步研究lrg基因的功能，需获得针对Lrg蛋白的特异性抗体，本室采用初步纯化后的6HisTATLrg融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人免疫血清.ELISA和r为（20～26）×103.SDSPAGE表明，本研究表达的融合蛋白与预期大小相符.通过蛋白融合，6HisTATLrg同样获得了快速穿膜特性，可在30min内迅速从培养液穿过细胞膜到达牙乳头细胞的胞质.这种快速穿膜特性对于研究该基因在真核细胞内的功能具有非常重要的意义.我们采用NiNTA纯化系统［12］

7、，专门用于纯化含有6His标签的重组蛋白，具有较高的纯化效率，初步纯化了Lrg蛋白.初步实验表明，我们获得的纯化蛋白和免疫血清,纯度和产量足以应用于lrg的组织分布和功能研究.SABCFITC实验表明，在牙乳头细胞中，加入的Lrg蛋白在胞质中均匀分布.而上述结果与免疫组化实验显示的Lrg在睾丸组织的分布结果一致,从而验证了实验结果的可靠性.【