lsectin-crd在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达

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1、中图分类号:R392硕士学位论文LSECtin-CRD在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达院（系）、所药学院研究生姓名汪明群学科、专业药理学导师姓名刘明华教授二Ο一三年四月目录LSECtin-CRD在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达11.1中文摘要……………………………………………………………11.2英文摘要……………………………………………………………31.3前言…………………………………………………………………61.4材料与方法…………………………………………………………91.5结果…………………………………………………………………221.6讨

2、论…………………………………………………………………311.7结论…………………………………………………………………351.8参考文献……………………………………………………………372英汉缩略词对照表…………………………………………………391[13抗肝癌血管生成的分子靶向药物研究进展（综述）………………………………………………………………………404致谢…………………………………………………………………41附1论文独创性及授权书………………………………………………51LSECtin-CRD在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达摘要目的：为了获得足量可

3、溶的重组蛋白C型凝集素（liverandlymphnodesinusoidalendothelialcellC-typelectin,LSECtin)糖基识别结构域（carbohydrate-recognitiondomains,CRDs），便于进一步用位置定向自旋标记-电子顺磁共振方法（SDSL-EPR）研究生理状态下蛋白行使功能时构象及运动性改变的动态结构信息，进行了一系列的原核重组蛋白表达实验的研究。方法：（1）重组表达质粒的构建：拟构建三个不同载体，[PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD和PGEX

4、-6p-LSECtin]。按实验目的对外源DNA片段（LSECtin和LSECtin-CRD）进行引物的设计与合成，PCR扩增，琼脂糖鉴定PCR扩增产物,鉴定正确后胶回收，双酶切鉴定正确的PCR片段，再次胶回收，获得纯化的外源DNA小片段；提取质粒[PET-22b(+)和PGEX-6p-1]，对质粒载体按实验要求双酶切后，胶回收，获得纯化的质粒DNA大片段。对质粒DNA[PET-22b(+)和PGEX-6p-1]以及外源DNA（LSECtin和LSECtin-CRD）进行浓度测定。连接外源DNA小片段和质粒载体DNA大片段。将成功连接的三个不同表达载体

5、[PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD和PGEX-6p-LSECtin]转化DH-5α感受态细胞，扩大培养后提取质粒，酶切鉴定正确后挑克隆摇菌送invitrogen公司测序。（2）重组蛋白诱导表达:将成功构建好的三个不同的表达载体[PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD和PGEX-6p-LSECtin]转化至两个不同的宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)]，挑单克隆，扩大培养，酶切鉴定正确，挑克隆进行重组蛋白诱导表达并进行SDS-PAGE检测蛋

6、白表达情况，以及进一步用Westernblot鉴定重组蛋白的表达。（3）重组蛋白的纯化复性:经优化比较，挑取表达良好的融合蛋白[Origami(DE3)-PGEX-6p-1-LSECtin-CRD]进行蛋白诱导表达，收集菌体，纯化复性，SDS-PAGE检测蛋白的纯度，保存蛋白。结果:成功构建三种不同的表达载体[PET-22b(+)-LSECtin-CRD,PGEX-6p-LSECtin-CRD，PGEX-6p-LSECtin]，在两种不同的宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)]中均成功表达大量重组蛋白，均以包涵体的形式存在。选取表达良好

7、的融合蛋白[Origami（DE3）PGEX-6p-LSECtin-CRD]进行纯化和复性，获得了足量可溶蛋白（PGEX-6P-1-LSECtin-CRD）。结论：成功构建三种不同表达载体[PET-22b(+)-LSECtin-CRD,PGEX-6p-LSECtin-CRD，PGEX-6p-LSECtin]，并在两种不同宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)]中稳定表达大量包涵体，通过纯化复性，获得了足量可溶蛋白（PGEX-6P-1-LSECtin-CRD）。本实验既为下一步用位置定向自旋标记-电子顺磁共振方法（SDSL-EPR）研究生理

8、状态下蛋白行使功能时构象及运动性改变的动态结构信息的实验奠定了坚实的基础，也为同行进行异源表达