鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究

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学校代码：10564学号：2014307444分类号：S831.79密级：硕士学位论文鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究周镇海第一指导教师：钟仰进教授第二指导教师：谢青梅教授学院名称：动物科学学院专业学位类别：农业推广硕士领域：养殖答辩委员会主席：毕英佐研究员中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要禽腺病毒是家禽常见的传染性病原体，会直接或间接地致病，大多数禽腺病毒在健康家禽体内复制但不产生明显的临床症状，当不良因素刺激，特别是疾病使动物免疫力下降，腺病毒则很快发挥其机会性病原体的作用。国内外曾报道了鸭腺病毒1型和2型，本研究分离鉴定的鸭腺病毒3型在国内外首次发现并报道，系统研究该病毒对鸭腺病毒病的防控具有重要的意义。本研究从国内发病番鸭体内分离到一株新型病毒，成功在鸭胚成纤维细胞上繁殖后，通过透射电子显微镜、血凝实验和理化实验对病毒粒子的形态和理化特征进行研究，实验结果证明该病毒属于新型腺病毒，并命名为CH-GD-12-2014。随后通过高通量测序，获得了该病毒的全基因组序列。全基因组序列分析表明CH-GD-12-2014株与2014年奥地利科学家AnaMarek发表的鸭腺病毒2型GR株具有92%的同源性。全基因组进化树也表明CH-GD-12-2014株、鸭腺病毒2型GR株和鹅腺病毒4型（GAdV-4）同属于Ⅰ群禽腺病毒属上的一分支。进一步分析显示CH-GD-12-2014株和GR株并不属于同一类型的鸭腺病毒。CH-GD-12-2014株有两个fiber基因，而GR株只有一个fiber基因。CH-GD-12-2014株的hexon氨基酸序列与GR株只有60%的相似性。结果表明CH-GD-12-2014株是另一种新型的鸭腺病毒，命名为鸭腺病毒3型（DAdV-3）。为了进一步研究该病毒的致病性，本研究以番鸭胚、SPF鸡、白鸭、番鸭和SPF绍兴麻鸭为研究对象。通过腿部肌肉注射病毒并定期解剖观察各组织器官的病变情况。同时采集组织样品（肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等）制作病理切片。实验结果表明：CH-GD-12-2014具有明显的致病性，感染率为100%。被感染动物的肝脏、心脏及肾脏等器官病变明显，其中肝脏最为严重，表现为黄化、肿大充血、质地变脆，表面有不同程度的出血点、出血斑以及大小不等的坏死灶等症状。动物免疫保护实验结果表明，灭活疫苗能刺激动物体产生一定量的抗体，对动物体起到一定的保护作用。本研究扩充了鸭腺病毒的研究，使鸭腺病毒的分类地位及遗传进化更加明确；为解决生产上腺病毒所带来的重大问题提供了科学依据，也给现在持续升温的腺病毒研究提供理论依据和实验方法。关键词：鸭腺病毒3型；全基因序列分析；致病性；免疫保护I GenonmicSequenceAnalysisandPathogenecityStudyofDuckAdenovirus3ZhouZhenhai(CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Aviadenovirusarecommoninfectiousagenttopoultry,whichcancausediseasedirectlyandindirectly.Mostaviadenovirusjustreplicateinhealthypoultrybutdonotcauseanyobviousclinicalsymptoms.Whenstimulatedbybadfactors,especiallydiseasesdeclineanimal’simmunity,adenovirusplaytheroleoftheopportunisticpathogensquickly.Duckadenovirus1and2hadreportedintheworld,whileduckadenovirus3isolatedandidentificatedbythisstudyisfirstlyfoundandreported.Itisveryimportanttostudythisvirusforpreventingandcontrollingduckadenovirusdisease.Theresearchtargetofthisstudyisanoveladenovirus(AdV)isolatedfromdiseasedMuscovyducksinChina.AftertheAdVwassuccessfullypropagatedinduckembryofibroblasts,themorphologicalandphysicochemicalpropertiesofthevirionswerestudiedbytransmissionelectronmicroscopy,hemadsorptiontest,physicalandchemicaltest.Theresultsshowthatthisvirusisanewtypeadenovirus.AnditisnameasCH-GD-12-2014.ThenthecompletegenomesequenceofADVwasobtainedwithhighthroughputsequencing.AnalysisofthecompletegenomesequencessuggestthattheCH-GD-12-2014sharedover92%sequenceidentitywithduckadenovirus2GRisolationwhichwasisolatedbyAustriascientistAnaMarekin2014.ThephylogeneticanalysisofthecompletegenomesuggeststhatCH-GD-12-2014,GRandGoAdV-4co-evolvedasonebranchofaviadenovirusI.FurtheranalysisshowedthatCH-GD-12-2014strainsandGRstrainwere'tthesametypeofduckadenovirus.CH-GD-12-2014strainhavetwofiber,whileGRstrainhaveonlyonefiber.AndCH-GD-12-2014sharedonly60%homologywithDAdV-2GRisolationinthehexonaasequences.ThesefindingssuggestthatCH-GD-12-2014isanothertypeofduckadenovirus-duckadenovirus3.Inordertolearnthevirusmore,wedonethepathogenecitytestwithMuscovyduckembryos,SPFchickens,whiteduck,Muscovyduck,SPFshaoxingSheldrake.Weinfectedtheexperimentalanimalsbyinjectionthevirusintolegmuscles,andregularlyobservethelesionoftheexperimentalanimals’stissuesandorgansafteranatomy.Inordertoconfirmtheinfectionandpathologicalchangeofexperimentalanimals,wecollectedthesamplesoftissuesandorgansformakingpathologicalsection,suchasliver,heart,muscularstomach,II glandularstomach,spleen,intestine,bursaoffabricius,kidney,lung,thymusglandandsoon.ResultsofpathogenicexperimentshowthattheCH-GD-12-2014hasstrongpathogenicityand100%infectionratetoexperimentalanimals.CH-GD-12-2014hasobviouspathogenictoorgansofinfectedanimals,suchasliver,heart,kidney,andtheliverismostserious.Theliverofinfectedanimalswasswellingandcongestion,andthesurfaceofliverhashemorrhagicspotorpetechiaeindifferentdegree.Someliverfadedtopaleyellowandwasbrittle.Thesurfaceofsomeliverhasnecroticlesionsindifferentsize.Theresultsofanimalimmuneprotectiontestshowthatitcanincreasetheduckadenovirusantibodylevelbyinjectedtheinactivevaccine.Thisstudyextendedtheresearchofduckadenovirus,andmadetheclassificationstatusandgeneticevolutionofduckadenovirusclear.Thisstudynotonlyprovidesscientificbasistosolvemajorproblemsthatadenoviruscausetoproduction,butalsoprovidesthetheoreticalbasisandexperimentalmethodsforthepopularadenovirusresearch.Keywords:DuckAdenovirus3;GenomeSequenceAnalysis;Pathogenicity;ImmuneProtectionIII 英文缩略词英文缩写英文全称中文全称aaaminoacid氨基酸dpidayspostinfection感染天数bpBasepair碱基对CPEcytopathogeniceffect细胞病变效应dday天ddH2Odoubledeionizedwater双蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBethidiumbromide溴化乙啶EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验TEMTransmissionelectronmicroscopy电镜ggram克hhour小时kbKilobasepair千碱基对LLiter升mgmilligram毫克minMinute分钟mLMilliliter毫升mol/LmoleperLiter摩尔每升mmol/LmillimoleperLiter毫摩尔每升ntNucleotide核苷酸ODopticaldensity光密度值ORFOpenreadingframe开放阅读框架PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应IV RNARibonucleicacid核糖核酸rpmrevolutionsperminute每分钟转数ssecond秒μMMicro-molperliter每升微摩尔TAETris-HCL，acetate，EDTAbufferTAE缓冲液UUnit单位UTRUntranslationregion非编码区µgmicrogram微克μLMicroliter微升SPFspecificpathogenfree无特定病原体美国国家生物技术信NCBINationalcenterforbiotechnology息中心µmol/LmicromoleperLiter微摩每升cDNACodingsequence编码序列HAHemagglutinin血凝素或血凝活性半数组织培养感染剂TCID50Tissuecultureinfectivedose量V 目录1前言.....................................................................................................................................11.1腺病毒..............................................................................................................................11.1.1形态学...........................................................................................................................11.1.2基因组结构...................................................................................................................21.1.3腺病毒蛋白...................................................................................................................31.1.4病毒的复制...................................................................................................................41.1.5腺病毒载体...................................................................................................................41.2禽腺病毒..........................................................................................................................51.3鸭腺病毒研究情况..........................................................................................................72材料与方法.........................................................................................................................92.1试验材料.........................................................................................................................92.1.1样品...............................................................................................................................92.1.2酶及其他试剂、试剂盒...............................................................................................92.1.3主要试剂及配置...........................................................................................................92.1.4主要仪器设备.............................................................................................................102.2病毒的鉴定....................................................................................................................112.2.1样品的采集和处理.....................................................................................................112.2.2样品的鉴定.................................................................................................................112.2.3病毒的分离培养.........................................................................................................142.2.4电镜观察.....................................................................................................................162.2.5全基因测序.................................................................................................................162.3病毒的理化和生物学试验............................................................................................162.3.1病毒的血凝实验.........................................................................................................162.3.2TCID50实验.................................................................................................................172.3.3病毒的理化试验.........................................................................................................172.4致病性试验....................................................................................................................182.4.1番鸭胚致病性实验.....................................................................................................182.4.2SPF鸡致病性实验.....................................................................................................19VI 2.4.3白鸭致病性实验.........................................................................................................232.4.4番鸭致病性实验.........................................................................................................242.4.5SPF绍兴麻鸭致病性实验..........................................................................................252.5免疫保护试验................................................................................................................262.5.1SPF绍兴麻鸭的孵化..................................................................................................262.5.2一免.............................................................................................................................272.5.3二免.............................................................................................................................272.5.4攻毒.............................................................................................................................272.5.5采血.............................................................................................................................272.5.6临床解剖观察.............................................................................................................282.5.7病理切片制作.............................................................................................................282.5.8抗体检测.....................................................................................................................283实验结果与分析...............................................................................................................313.1病毒分离鉴定结果........................................................................................................313.1.1病毒初步PCR鉴定结果...........................................................................................313.1.2病毒在DEF细胞上培养结果...................................................................................313.1.3进一步PCR结果......................................................................................................323.1.4电镜观察结果.............................................................................................................323.1.5高通量测序结果.........................................................................................................333.2理化和生物学试验结果................................................................................................373.2.1血凝实验.....................................................................................................................373.2.2TCID50实验................................................................................................................373.2.3理化实验.....................................................................................................................383.3致病性试验结果............................................................................................................393.3.1番鸭胚致病性实验结果.............................................................................................393.3.2SPF鸡动致病性实验结果..........................................................................................403.3.3白鸭致病性实验结果.................................................................................................423.3.4番鸭致病性实验结果.................................................................................................443.3.5SPF绍兴麻鸭致病性实验结果..................................................................................473.4动物保护试验结果........................................................................................................51VII 3.4.1SPF绍兴麻鸭孵化结果..............................................................................................513.4.2临床症状及剖检观察.................................................................................................513.4.3病理切片结果............................................................................................................523.4.4血清抗体检测结果.....................................................................................................534讨论...................................................................................................................................574.1分离鉴定结果和序列分析............................................................................................574.2病毒理化和生物学试验结果分析................................................................................584.3致病性试验结果分析....................................................................................................594.4动物保护试验结果分析................................................................................................615总结...................................................................................................................................63致谢......................................................................................................................................64参考文献..............................................................................................................................65附录：硕士期间发表论文..................................................................................................70VIII 1前言1.1腺病毒腺病毒最早是在1949年将牛结节性皮炎病料接种到鸡胚中分离到的（VANDENENDEetal.,1949）。随后在1953年科学家Rowe等也从小儿扁桃体中分离出了人腺病毒（ROWEetal.,1953）。以后从许多脊椎动物身上都分离出腺病毒，每一脊椎动物都有它们的腺病毒。由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。根据宿主范围的不同，腺病毒最早分为禽腺病毒属（Aviadenovirus）和哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）。2005年，国际病毒分类委员会（ICTV）在第八次报告会上公布了腺病毒分类的新标准，从本质上改变了腺病毒的分类（FauquetCMetal.,2005）。腺病毒的确定需要根据系统发育距离、宿主范围、限制性酶切片段、致病力、交叉中和作用以及遗传重组的可能性等各项重要指标中的2项，尤其是序列数据和限制性酶切图谱。据此，腺病毒科便由原来的2个属（禽腺病毒属和哺乳动物腺病毒属）变为4个属，即禽腺病毒属、哺乳动物腺病毒属、富AT腺病毒属（Atadenovirus）和唾液酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。其中唾液酸酶腺病毒属（Siadenovirus）包括蛙腺病毒A型（FrAdV-A）和将以前的Ⅱ群禽腺病毒（AASV、HEV和MSD）统称为火鸡腺病毒A型（FAdV-A）。富AT腺病毒属（Atadenovirus），基因结构相似，A、T含量较高，包括减蛋综合征病毒（EDSV）、有袋目动物腺病毒以及一些反刍动物腺病毒。国际病毒分类委员会（ICTV）在第九次报告会上又增加了美洲白鲟腺病毒属（Ichtadenovirus），腺病毒增加到了5个属（Harrach,2011）。哺乳动物腺病毒属感染各种物种，如猴子、羊和牛（Barbezangeetal.,2000；Bartha,1969；Rusvaietal.,2000）；富AT腺病毒属感染蛇和鸟等（Farkasetal.,2008；Hessetal.,1997）；禽腺病毒属主要感染禽类（Chioccaetal.,1996；Schrenzeletal.,2005）。唾液酸酶腺病毒属已经在青蛙，鸟类和龟报道过（Davisonetal.,2000；Kovacsetal.,2011；Kovacsetal.,2010；Pitcovskietal.,1998）；美洲白鲟腺病毒属已经在鱼报道过了（Kovacsetal.,2003）。1.1.1形态学腺病毒为线状双股DNA病毒，直径70-110nm，呈二十面体对称，无囊膜。腺病毒核心蛋白形成直径60-65nm的髓芯，被包裹在衣壳内。衣壳由252个壳粒组成，壳粒直径为8-10nm，排列在三角形的面上，每边6个，其中的240个为六邻体（非顶点壳粒），12个则是五邻体基底（顶点壳粒）。每个五邻体基底结合着1根至2根纤维突起。1 这些突起以五邻体蛋白为基底由衣壳面伸出，在顶端处形成头节区。腺病毒感染细胞后，一般在核内呈晶格状排列。图1.1腺病毒结构图（贺小英，2011）1.1.2基因组结构腺病毒基因组大小存在较大的差异，人腺病毒2型为36kb，而HEV为26kb。腺病毒DNA分子的两端都具有一段反向重复序列（ITR），不同型和株的病毒重复的次数及长度不同。重复的次数和长度也与传代次数有关。并且每个ITR可分为AT富集区和GC富集区。腺病毒基因组的左端载有包装信号，包装信号和ITR是基因组复制和病毒包装不可缺少的顺式作用元件。基因组5'端有共价结合的和腺病毒感染有关的末端蛋白（TP），对启动腺病毒DNA的复制起着重要的作用，含有TP的病毒感染性能提高100倍。根据腺病毒DNA复制的起始时间，基因组分为早期转录基因（E）以及晚期转录基因（L）。早期转录基因包括E1A、E1B、E2A、E2B（TP、pol、pIVaII）、E3（ADP等）及E4。晚期转录主要起始于晚期启动子（MLP），并且根据终止位点和剪切方式不同，分为5组：L1（52/55K、pIIIa）；L2（penton、pV、pVII、pX、u）；L3（pVI、hexon、EP）；L4（100K、33K、pVIII）和L5（fiber）。其中E2A、E2B、E4是由反（L）链编码，其他基因位于正（R）链。腺病毒MLP保守序列为TATAAAA，上游一般含有ATTGG的CAAT盒子以及CACGTG的UPE启动子元件，下游都有2 TCACTCT样的INR元件和TTGT-CAGTTTC（DE1）样AACGAGGAGGATTTGA（DE2）的激活元件。MLP上游激活元件一般比较保守，而下游调控元件不大保守。早期基因E1A和E1B表达蛋白参与病毒基因以及有关细胞基因的转录，是病毒基因活动起始因子；E2A和E2B的功能主要是参与和调节病毒DNA复制；E3基因表达的产物和病毒逃避宿主免疫系统有关，是病毒复制非必需区。病毒缺少大部分甚至全部分E3仍然能在组织培养细胞上繁殖；E4则参与病毒DNA的复制、宿主细胞生物合成终止、晚期基因的表达和转录子的拼接活动等。晚期基因则主要编码结构蛋白，是装配成熟的毒粒所必需，所以基因结构比较稳定。晚期转录区域有一个共同的三联先导序列（TPL），是由主要晚期启动子（MLP）所启动，转录产物是多顺反子，可达20kb，然后通过不同剪切加工，产生不同mRNA，再翻译成不同病毒蛋白。1.1.3腺病毒蛋白腺病毒蛋白包括结构蛋白和非结构蛋白，结构蛋白有衣壳蛋白和核蛋白。衣壳蛋白主要包括六邻体（pII）、五邻体（pIII）、纤维蛋白（pIV）、pVIII和pIIIa等。六邻体蛋白大小约为109ku，是主要的结构蛋白，含有主要的属特异性抗原决定簇。纤维蛋白约62ku，由前体蛋白水解后糖基化而来。纤维蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇。五邻体大小约为63ku，由5个多肽相互作用而成。五邻体能帮助病毒与细胞结合，有助于侵入和内化。pIIIa大小约为64ku，对病毒粒的装配和维持结构起着重要作用，与病毒侵入细胞也有关。pVIII大小25ku，是一种六邻体相关结构蛋白。pVI和pIX也是六邻体相关蛋白，起组装和稳定粒子的作用。核蛋主要白包括pV、pVII、pX、u与TP。pV属于次要核蛋白大小约为42ku，起连接五邻体基底和基因组DNA的作用。pVII是主要核蛋白大小约为22ku，与DNA非共价结合，形成“染色体”样结构。PX和u具体位置不清楚。TP（末端蛋白）约为55ku，在DNA复制过程中充当引物。还可以促进DNA聚合酶（pol）在宿主细胞内的核定位。腺病毒的非结构蛋白主要有E1A、E1B、DBP（E2A）、ADP（E3）、E4、pol、EP、pIVaII、52/55K、100K和33K等。病毒周期从E1A蛋白表达开始，E1Ａ蛋白可以激活其他早期基因的启动子。E1A则可以拮抗干扰素和诱导细胞增加对肿瘤坏死因子（TNF）介导的杀伤作用敏感性。E1B和E4蛋白可以打断宿主细胞mRNA的转录和翻译。E3编码的几个蛋白则起到抗干扰素和加速感染细胞死亡的作用。DNA聚合酶（pol）和DNA结合蛋白（DBP）是早期基因编码的病毒DNA复制所必需的蛋白。此外，DBP还参与病毒宿主范围的选择和病毒转录以及转录后水平基因表达调控。3 pIVaII，一种DNA结合蛋白，能转录激活晚期基因的表达。52/55K蛋白，可参与装配过程中病毒DNA与壳粒的识别作用，还有可能参与MLP的转录调控。腺病毒感染后期含量最丰富的蛋白是100K蛋白。内肽酶（EP）在腺病毒中较保守，对病毒粒子的成熟及感染力至关重要。33K蛋白参与衣壳的形成，是空壳粒子的组成成分。1.1.4病毒的复制腺病毒首先通过纤突头节区与敏感细胞膜上的特异柯萨奇-腺病毒受体结合（人腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，故这种受体称为柯萨奇-腺病毒受体），然后通过细胞表面整合蛋白诱导的胞饮作用，再由内吞小泡通路进入细胞。进入细胞后内吞小泡pH值降低，病毒粒子外壳上纤维蛋白脱落，随后五邻体基底也从外壳解开，直至最后整个外壳崩解。病毒DNA就从溶解的内吞小泡释放到宿主细胞核中。随后便开始了病毒基因组的转录。病毒周期从E1A蛋白的表达开始，DNA复制前是其早期，DNA复制后是其晚期。其他早期基因的启动子由E1A蛋白负责激活。复制周期的晚期主要是基因组的复制和由MLP控制的结构基因的表达，还伴随宿主细胞转录和翻译的抑制。在宿主细胞核中组装成新的外壳后，结构蛋白将复制的病毒基因组包装进去，便构成了具有感染力的完整病毒子。一旦宿主细胞凋亡便释放出来（戴志红等，2007）。1.1.5腺病毒载体腺病毒载体由于具有易感性、病毒颗粒比较稳定、宿主范围广泛、对人体的低致病性和病毒滴度高等优点，已经成为最常用的病毒载体之一。在过去的15年里已经得到充分地证实腺病毒载体具有高效传递和表达基因的能力。目前，腺病毒载体广泛应用，主要集中在与基因相关疾病的治疗中。通过腺病毒载体将外源基因导入动物体细胞内，该基因所表达的蛋白能治愈疾病或延缓疾病。腺病毒载体也已在多种基因治疗的基础性研究中崭露头角，在2000年构建了CAR胞外区与靶向性配体，即表皮生长因子（EGF）融合的蛋白，与腺病毒联合感染表达EGF受体的细胞，达到了理想效果（Krasnykhetal.,2000）。但细胞的靶向性和宿主的免疫反应也限制了腺病毒载体的应用和发展。因此关于腺病毒载体地运用也在不断改进和完善。关于腺病毒载体的构建已经有三代。第一代腺病毒载体是用体外连接方法构建的。在第一代腺病毒载体的基础上第二代腺病毒载体进一步完善和发展起来。着眼点是降低重组病毒载体诱导产生的免疫反应。近几年，第三代腺病毒载体也有了较大的突破（金天明等，2007；刘根梅等，2010）。4 1.2禽腺病毒禽腺病毒广泛分布在世界各个养殖场中。禽腺病毒每年的感染数量都在增加，尤其是近两年以包涵体肝炎为特征的禽腺病毒的发病情况日益严重（Zhaoetal.,2015；刘东等，2015）。禽腺病毒根据不同群特异性抗原分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群（黄庚明等，1996）。Ⅰ群禽腺病毒包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，具有共同的群抗原，共12个血清型，有鸡胚致死性孤儿病毒和包涵体肝炎病毒等。该群病毒在鹅、鸡、鸭体内普遍存在，使鸡群呈阴性感染，并作为继发病原共同作用家禽，且能垂直传播，污染鸡胚（Guyetal.,1997）。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒和大理石脾病病毒等，这些病毒群抗原和Ⅰ群禽腺病毒不同（Domermuthetal.,1980）。Ⅲ群禽腺病毒，即与减蛋综合征有关的一类病毒，可从鹅、鸡、鸭体内分离获得（McFerranetal.,1978）。国际病毒分类委员第8次报告做出调整后，禽腺病毒的分类也做出调整（如表1.1所示）。表1.1禽腺病毒的分类（ICTV）（张明明，2008）GenusSpeciesSerotypesStrainsAviadenovirusFowladenovirusAFAdv-1CELO（FAdv-A）112phelpsFowladenovirusBFadv-5340（Fadv-B）TR22FowladenovirusCFadv-4KR-5（Fadv-C）J-2Fadv-10C-2BM-11CFA20FowladenovirusDFadv-2GAL-1（Fadv-D）685SR48Fadv-3SR4975Fadv-9A2[A2-A]905 Fadv-11380FowladenovirusEFadv-6CR119（Fadv-E）168Fadv-7YR36X-11Fadv-8aTR59T-8CFA40?Fadv-8b764B3H6GooseadenovirusGoAdvGoAdvGoAdv-2GoAdv-3TentativeSpeciesDuckadenovirus（DAdV）Duckadenovirus2（DAdV-2）Pigeonadenovirus（PiAdV-1）Turkeyadenovirus（TAdV）Turkeyadenovirus1（TAdV-1）Turkeyadenovirus2（TAdV-2）AtadenovirusDuckadenovirusADuckadenovirus1EDSV（AV127）（DAdV-A）（DAdV-1）SiadenovirusTurkeyadenovirusATurkeyadenovirus3Pheasantadenovirus1（PhAdV-1）（TAdV-A）（TAdV-3）MarblespleendiseaseVirus（MSDV）HemorrhagicenteritisVirus（HEV）禽腺病毒是家禽常见的传染性病原体，会直接或间接地致病，大多数禽腺病毒在家禽6 体内复制但不产生明显的临诊症状，当不良因素，特别是其他疾病使家禽免疫力下降，腺病毒则很快发挥其机会性病原体的作用。禽腺病毒还能诱导感染禽类产生高水平的中和性循环抗体：即在已经感染了病毒的情况下，宿主仍然再次受到病毒的再次感染。腺病毒在细胞核内复制，其复制在很大程度上受宿主免疫应答的调控（张科，2005）。本论文中研究的病毒在很多地方都表现出与禽包涵体肝炎和心包积液综合征相似的形状。禽包涵体肝炎是由I群禽腺病毒（fowladenovirusI，FAdV-I）的某一些血清型引起的以侵害肝脏为主并且在肝细胞中形成核内包含体为特点的传染病。感染鸡群，初期见不到明显的症状，有个别鸡只会突然死亡，但多为体况良好的鸡。感染2～3d后少数鸡表现为食欲不振，精神沉郁，嗜睡等症状，还有的鸡颜面苍白，皮肤呈黄色，鸡冠褪色，并可见到皮下出血（国纪垒，2012）。该病的特征性病理变化在肝脏，临床症状表现为肝脏肿大，表面有不同程度的出血点和出血斑，肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆。还有的肝脏可以见到大小不等的坏死灶，有时坏死灶和出血交相混合，肝脏表面呈现出凹凸不平的感觉。组织学上表现为肝脏充血、出血，肝细胞脂肪变性，并伴发局灶性坏死和胆汁淤积，在肝细胞核内还可发现嗜碱性或嗜酸性的包含体，边缘较大而清晰，呈圆形或形状不规则（Asthanaetal.,2013；Ernyetal.,1991；Mittaletal.,2014）。1.3鸭腺病毒研究情况目前，文献报道鸭腺病毒有鸭腺病毒1型和鸭腺病毒2型。鸭腺病毒l型（Duckadenovirus1，DAdV1）病毒是与产蛋下降综合症相关的一种无囊膜的双股DNA禽腺病毒，属于腺胸腺病毒属（Atdaneoviurs），与I群禽腺病毒存在很小的共同抗原。发病鸭产蛋率大幅度下降。少数发病鸭采食量减少，精神轻度沉郁，产出畸形蛋、软壳蛋，死亡率为1%～5%。发病初期增加饲料中矿物质、蛋白含量和微量元素，病情未见好转（Brashetal.,2009；冯涛，2006；刘尚高等，1996）。关于鸭腺病毒2型的研究要从1977年法国爆发的一场大规模疾病说起。1977年，从法国番鸭中爆发的大规模疾病中分离了一种病毒，该病毒能产生腺病毒抗体。感染病鸭体重下降，有些站不稳。感染鸭从35日龄左右开始持续10d每天都有1-1.5%的死亡率。1982年北爱尔兰科学家Bouquet等对分离的病毒进行了研究。他们通过禽腺病毒组抗原比对、确认该病毒与12个FAdV、2个TAdV和DAdV-1不同，是一种新型的禽腺病毒（Bouquetetal.,1982）。2011年，Harrach等科学家再次证明该病毒是一个新的病毒并提议命名为DAdV-2，但由于缺乏序列，提议没被ICTV采纳（Harrach,2011）。7 直到2014年，奥地利科学家AnaMarek通过高通量测序技术才获得该病毒全序列，并对该序列进行分析（Mareketal.,2014）。同年，广东地区番鸭场，番鸭出现类似该病死亡的情况。剖检发现病鸭出现严重肝脏肿大、斑驳状出血、白色点状坏死等症状。鸭的死亡率超过20%。通过PCR鉴定初步猜测该病毒为鸭腺病毒。为了明确该病毒的分类地位及遗传进化，扩充鸭腺病毒的研究，非常有必要展开对该病毒的深入研究。更为重要的是为了减少生产以及国民经济损失，对该病毒的系统性研究迫在眉睫！8 2材料与方法2.1试验材料2.1.1样品2014年，从广东某鸭场采集到的疑是肝坏死病鸭的肝脏。本实验室鉴定并保存的鸭腺病毒3型CH-GD-12-2014。番鸭受精蛋105枚，1日龄白鸭53只，SPF受精蛋55枚，SPF绍兴鸭受精蛋110枚。2.1.2酶及其他试剂、试剂盒Ex-Taq酶、DL-2000DNAMarker等购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒（StoolDNAKit）购自OMEGA公司；Tris碱、EDTA为Promega公司产品；溴化乙锭（EB）等为Sigma公司产品；小牛血清：GIBCO公司产品，无菌分装后-20℃保存备用；DMEM培养液及胰酶等购自GIBCO公司产品；甲醛、乙醚、丙酮、氯仿等购自健阳。2.1.3主要试剂及配置PBS缓冲液（pH7.3）：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存备用。0.9%生理盐水：NaCl0.9g，将蒸馏水加至100mL，121℃高压灭菌后使用。鸡1%红细胞悬浮液的制备：采3只及以上成年健康公鸡的鸡血来提供红细胞。在注射器中事先加入10%灭菌柠檬酸三钠溶液0.5mL，然后采血至5mL，轻微摇匀，1500rpm离心10min左右，再用吸管吸去上清液和白细胞薄膜，再将沉淀的红细胞加生理盐水进行重悬，如此重复洗涤红细胞3~4次，最后弃去上清液，按红细胞体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，置4℃一般保存2~3d为宜。鸭1%红细胞悬浮液的制备的将公鸡血换成公鸭血外方法同上。抗生素溶液：以PBS缓冲液为溶剂，青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50µg/mL）和制霉素（1000IU/mL），调节pH值至7.0~7.4，分装-20℃保存备用。无RNA酶的DEPC水：按1：1000的比例将DEPC加入三蒸水中，室温放置12h以上，然后高压灭菌。9 50×TAE缓冲液：Tris碱242g，Na2EDTA37.2g，冰醋酸57.1mol/L，加去离子水定容至1000mL，使用时稀释为1倍。核酸染料EB替代物Goldview：购自广州美津生物技术有限公司（Paragon公司产品，CatalogNo.PG130102）。酶标二抗：羊抗鸭IgG辣根过氧化物酶（Peroxidase-conjugatedAffinipureGoatAnti-SwineIgG（H+L），购自广州美津生物技术有限公司，美国ProteinTech公司产品，CatalogNo.SA00001-5，-20℃保存）。底物TMB购自广州建阳生物科技有限公司；Tween-20、BSA购自广州美津生物公司，为Sigma公司产品。96孔平底聚苯乙烯酶标板、96孔细胞培养板为美国Corning公司产品。包被缓冲液：0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液、1.59gNa2CO3、2.93gNaHCO3，蒸馏水加至1000mL。洗涤缓冲液：0.15MPBS（pH7.2）、0.2gKH2PO4、2.85gNa2HPO4·12H2O、8gNaCl、0.2gKCl、0.5mL、Tween-20（0.05%）0.5mL、加蒸馏水至1000mL。封闭液：10％胎牛血清/PBS、1%BSA/PBS、5%脱脂奶粉/PBS（分别取10mL、1g、5g胎牛血清、BSA、脱脂奶粉加入PBS定容至100mL即可），现配现用。稀释缓冲液（血清稀释液）：5％胎牛血清/PBS、0.1%BSA/PBS、1%脱脂奶粉/PBS、5％马血清/PBS（分别取5mL、0.1g、1g胎牛血清、BSA、脱脂奶粉加入PBS定容至100mL即可），现配现用。底物缓冲液：A液为TMB（10mg/10mL无水乙醇）；B液为0.2mol/LpH6.0的醋酸钠溶液；C液为0.03%H2O2。现配现用：A液1mL+B液4mL+C液5mL。终止液：1MH2SO4（蒸馏水：189.2mL，逐滴加入浓硫酸（98%）10.82mL）。2.1.4主要仪器设备超纯水系统（MILLIPORE，美国）；PCRExpressGradientPCR仪（HYBAID，法国）；pH计（METTLERTOLEDO，瑞士）；CO2细胞培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；光学倒置显微镜（Nikon公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；低温冰箱（中国青岛海尔公司产品）；10 超低温冰箱（ThermoScientificForma，美国）；高速冷冻离心机（上海天美科学仪器有限公司）；超速离心机（Beckman，美国）；OLYMPUS光学显微镜：日本奥林巴斯株式会社产品；BiometraPCR仪：德国Biometra公司产品；Bio-RAD电泳系统：美国Bio-Rad公司产品；凝胶图像分析系统，英国UVITEC公司；精密电子天平（P324S），江苏常熟双杰测试仪器厂；微量移液器（2μL/20μL/200μL/1000μL），法国吉尔森公司；电子天平（上海紧密科学仪器有限公司产品，型号FA2004N）；高压灭菌锅（AYAMA公司产品，型号：HV-85HIR）；制冰机（日本SANYO公司产品），Rios纯水系统（美国Millipore公司产品）等；酶标仪：山东高密虹彩分析仪器厂产品。2.2病毒的鉴定2.2.1样品的采集和处理将从鸭场采集到的病鸭肝脏放到研钵，加入液氮进行研磨，待研磨充分加入一定量的双抗混匀并用移液枪移入离心管，然后放到-80℃冰箱保存。2.2.2样品的鉴定2.2.2.1DNA的抽提将保存在-80℃的病鸭肝脏研磨液经三冻三解后进行离心。10000rpm离心10min后取上清用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤。取滤液后按照OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA的抽提。抽提的方法如下：（1）从-80℃冰箱取出样品液，置于冰上。（2）向2mL离心管中加入250µL样品液、10µLOB蛋白酶和250µL含有4µLLinearAcrylamide的butterBL。（3）漩涡震荡15s后放进65℃水浴锅中水浴10min，水浴期间震荡2-3次。（4）从水浴锅中取出离心管，用已经消毒的纱布擦掉离心管上的水，加入260µL无水乙醇。（5）漩涡震荡20s后简单离心，使一些较大的细胞碎片和杂质沉淀。（6）用移液枪将离心管中的溶液转移到套在新的2mL离心管上制备管中。800011 rpm离心1min。（7）将制备管转移到新的2mL离心管，向制备管加入500µLbutterHB，8000rpm离心1min。（8）倒去离心液，向制备管加入700µLDNAWASHButter，8000rpm离心1min。（9）重复第（8）步骤。（10）倒去滤液，用大于13000rpm的转速空离1min。（11）将制备管转移到新的1.5mL离心管。（12）吸取50-65µL已经在65℃烘箱中预热的ElutionButter加入到制备管中（加液过程中要注意把buffer悬空滴到滤膜上，切忌加到旁边的空隙中）。（13）室温静置5min，然后8000rpm离心1min。（14）将过滤液重新加到制备管中，室温静置5min，然后8000rpm离心1min。离心后的滤液即为所提取DNA，保存于-20℃温冰箱中。2.2.2.2PCR初步鉴定（1）根据NCBI上已经公布的6种鸭病毒序列设计6对相对应的引物（见表2.1）检测从上一步骤病鸭肝脏所抽提的病毒DNA，初步鉴定该病。12 表2.16对鸭病毒引物名称上下游引物（5`-3`）DuckenteritisvirusF：CGGCGGATTATGCTGTR：ACCATTGTTTGTGGCTTCTMuscovyduckparvovirusF：CGCTTGAGCACGATR：GTCTCCACCCTACACCDuckhepatitisBvirusF：AATGGGCGTCGGTCTCR：GGTTTGTGCCTGGATGGDuckhepatitisvirusF：ACCTGCTGGGAACGR：TGGGTGGAATAGATAGTGDuckreovirusF：CACTATTGACGCACTTACR：ACGCCAACTGAACGDuckadenovirus2F：CACTCACGGGAACTGR：GGGCACCACAAACG（2）PCR扩增以2.2.2.1步骤中抽取的DNA样品作为模板，用步骤（1）设计的6对引物进行PCR反应。6个PCR反应的体系都如表2.2所示，唯一不同的是所加的引物不同。表2.2PCR反应体系成份体积模版DNA1μL2×PCRTaqStarMix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLddH2O8μLTotalvolume20µL注：其中以鸭腺病毒为引物的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环；72℃延伸10min；4℃forever13 （3）PCR扩增产物的检测扩增后取10μLPCR产物，点样于1%琼脂糖凝胶孔（加有Goldview染液）上进行电泳，以DNAMarkerDL2000作为参照。电泳结束后在GDS-8000PC型凝胶成像系统进行观察。2.2.3病毒的分离培养经上述步骤初步鉴定该病毒为鸭腺病毒后，进行病毒在鸭胚成纤维细胞上的培养来做进一步确定。2.2.3.1鸭胚成纤维细胞的培养（1）准备鸭胚、手术器械、培养基和血清等在超净工作台内。将鸭蛋气室端（钝端）向上直立于6孔板上，用酒精棉球消毒蛋壳，待酒精挥发后，用镊子小心击破气室端蛋壳并弃之，撕破卵膜，暴露出鸭胚，用镊子小心取出胚胎于装有PBS灭菌培养皿中。剪去鸭胚的头部、翅、爪及内脏，用PBS溶液洗3次，移入另一装有PBS的3灭菌培养皿中，用灭菌剪刀剪碎鸭胚，使其成为小于3mm的组织块后用移液枪移入离心管中，加PBS溶液轻摇。（2）消化：加入一定量的0.25%胰蛋白酶轻轻摇匀。然后置于37℃水浴箱中水浴，每几分钟轻轻摇动1次，直至液体变均匀即可终止消化。这个过程一般需要20-30min。（3）终止消化：往离心管中加入血清并充分混匀以稀释胰酶浓度，进而终止胰酶的消化。（4）离心：将悬液用100目细胞筛过滤，用移液枪收集过滤液于5mL离心管中，8000转离心5min，去掉上清后加入DMEM用移液枪轻轻吹打，将细胞吹匀。（5）细胞计数：取细胞悬液0.5mL加入0.1％台盼蓝（0.1mol/L）溶液2mL，在室温下放置10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴入血细胞到计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。5（6）将细胞悬液用DMEM培养液稀释至5×10个/mL（含10%的血清），接种至培养皿，置入37℃、50%CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，观察细胞的生长情况。2.2.3.2细胞攻毒实验（1）等DEF细胞生长到24h后用移液枪移除培养液。将2.2.1步骤中的病毒研14 磨液三冻三解后10000rpm离心10min，取上清用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜进行过滤。攻毒组取适量的过滤液敷到培养24h的DEF细胞上，对照组则加等量的DMEM到DEF细胞上。（2）攻毒后置于37℃、CO2培养箱内进行培养。（3）2h后在对照组和实验组培养皿中分别加入等量的DMEM维持液（含有2%的血清）。（4）置于37℃、CO2培养箱内进行培养。每天观察和记录的DEF细胞生长情况。（5）攻毒4-5d后开始收毒。将攻毒组中含有病毒的细胞液置于-80℃冰箱中进行保存。2.2.3.3病毒液的传代收取攻毒组的细胞液三冻三解后10000rpm离心10min取上清用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤。然后取过滤液敷到新培养的生长24hDEF上进行病毒的培养，如此反复循环进行病毒的传代。2.2.3.4进一步PCR鉴定将上述细胞培养的病毒液三冻三解后10000rpm离心10min取上清用孔径大小为0.22um的微孔滤膜过滤。然后取过滤液按照OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA的抽提。抽提方法同2.2.2.1步骤。将抽提的病毒DNA作为模板DNA进行PCR反应，所用的引物根据GeneBank中公布的鸭腺病毒2型hexon基因序列设计，如表2.3所示。表2.3鸭腺病毒引物名称上下游引物（5`-3`）G1F：CACTCACGGGAACTGR：GGGCACCACAAACGG2F：TGGGTCCAAATCAGR：GGGCACCACAAACGPCR反应体系及扩增体系同2.2.2.2步骤。PCR扩增后取10μLPCR产物，点样于1%琼脂糖凝胶孔（加有Goldview染液）中，同时点10μLDNAMarkerDL2000作为参照，电泳结束后在GDS-8000PC型凝胶成像系统上进行分析。15 2.2.4电镜观察（1）取200mL病毒液10000rpm离心10min后取上清用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤。取过滤液从而去除细胞碎片。（2）将上述过滤液置于超速离心机中40000rpm，4℃离心3h，去上清取沉淀。然后用少量PBS将沉淀吹打下来，使病毒溶于PBS中。（3）用移液枪吸取上述含有病毒粒子的PBS液50μL点于1次性手套上，将碳膜铜网放在50μLPBS上沾样。（4）30min后用滤纸从铜网边吸干多余的液体，然后将2%的磷钨酸滴在铜网上闭光染色10min，用滤纸吸干染液便可以进行电镜观察。（5）拍摄观察到的病毒粒子的电子显微镜照片。2.2.5全基因测序将收集的病毒液三冻三解后10000rpm离心10min钟后用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤。然后取过滤液按照OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA的抽提。抽提方法同2.2.2.1步骤。抽提完DNA后测DNA的浓度，当DNA的浓度大于100ng/μL，OD260/OD280≈1.8时送公司进行高通量测序。2.3病毒的理化和生物学试验2.3.1病毒的血凝实验2.3.1.1鸭血血凝实验（1）取洁净的96孔v型微量血凝版，每孔依次加入50μLPBS（pH=7.2）。（2）吸取50μL病毒液加入第l孔，轻轻混匀后从第1孔吸取50μL加入第2孔，混匀后吸取50μL加入第3孔，如此进行对比稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL弃之。第12孔不加病毒液作为对照。（3）每孔均加入50μL体积分数为1%鸭红细胞悬液（将鸭红细胞悬液充分摇匀后加入）。（4）振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1h）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。（5）结果判定：将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾斜（45rad左右），观察血凝板，判读。2.3.1.2鸡血血凝实验方法同鸭血凝实验，唯一不同的是（3）中每孔均加入50μL体积分数为1%鸭红16 细胞悬液改为每孔均加入50μL体积分数为1%鸡红细胞悬液。2.3.2TCID50实验（1）在96孔板上每孔加入100μL含10%血清的DEF细胞，铺满单层，丰度为60%，置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。（2）待96孔板上的DEF细胞生长到24h去除培养液，在96孔板第一排加入100μL病毒原液，第二排加入100μL稀释10倍的病毒液，第三排加入100μL稀释100倍的9病毒液，以此类推；第10排加入100μL稀释10倍的病毒液，第11和12排加入100μLDMEM培养液。然后置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。孵育2h后吸去病毒液向每孔加入100μL含有2%血清的DMEM维持液作为对照，然后置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。（3）培养4-5d后，开始观察并记录细胞的病变情况，计算TCID50。2.3.3病毒的理化试验2.3.3.1病毒的理化处理（1）有机溶剂处理：取1mL病毒液置于4个2mL离心管中，按照病毒液：有机溶剂=4：1的比例分别在4个离心管中加入0.25mL甲醛、乙醚、丙酮、氯仿，充分振荡，并在室温作用1h后3000rpm离心10min去除有机溶剂取病毒液，然后保存于-80℃备用。（2）不同pH值的处理：取1mL病毒液置于2mL离心管中，用NaOH和HC1将病毒的pH值分别调为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，室温作用1h后将pH值都调回7，然后保存于-80℃备用。（3）紫外线照射处理：取1mL病毒液置于2mL离心管中，轻轻摇匀，在紫外灯下照射1h进行处理，然后保存于-80℃备用。（4）改变不同温度的处理：将lmL病毒液置于2mL离心管中，分别于37℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃水浴锅中水浴1h候进行处理，然后保存于-80℃备用。2.3.3.2经过处理的病毒液的TCID50试验（1）在96孔板上每孔加入100μL含10%血清的DEF细胞，铺满单层，丰度为60%，然后置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。（2）待96孔板上的DEF细胞生长到24h去除培养液，在96孔板第一排加入100μL经过紫外照射1h的病毒液，第二排加入100μL稀释10倍的经过紫外照射1h的病毒17 液，第三排加入100μL稀释100倍的经过紫外照射1h的病毒液，以此类推；第10排9加入100μL稀释10倍的经过紫外照射1h的病毒液，第11和12则排加入100μLDMEM培养液作为对照。然后置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。孵育2h后吸去病毒液向每孔加入100μL含有2%血清的DMEM维持液，然后置于37℃、CO2恒温培养箱进行培养。其他24个处理组的敷毒过程和以上步骤相同，不同的是按稀释度加入的不是经紫外照射1h的病毒液，而分别是37℃水浴1h的病毒液、50℃水浴1h的病毒液和甲醛作用1h等的病毒液。（3）培养4-5d后，开始观察并记录细胞的病变情况，分别计算不同理化处理组的TCID50。2.4致病性试验2.4.1番鸭胚致病性实验将40枚授精番鸭胚放到孵化箱进行孵化。等到鸭胚孵化到8日龄时，随机分成A、B两组，每组20枚鸭胚。A组每枚鸭胚通过绒毛尿囊膜注射300μLCH-GD-12-20145.25病毒液（0.3x10TCID50）作为攻毒组，B组每枚鸭胚通过绒毛尿囊膜注射300μLDMEM培养液作为对照组。注射病毒液和DMEM培养液的方法相同。下面以注射病毒液为例介绍注射的过程。（1）在蛋壳上用铅笔划出气室与卵壳膜的交接界线，在交接界线上方5mm处寻找其下方靠近胚胎又无血管的地方标上记号作为打孔的地方。（2）在标记处先后用5%碘酊及75%的酒精棉消毒，然后用灭菌的打孔器打一小孔，用注射器吸取300μL病毒液从打孔的地方向下打入1cm左右的深度，使针头刚好穿过绒毛尿囊膜，病毒液刚好注射到尿囊腔。（3）注射完毕后立刻用熔化的石蜡封孔并做好标记。注射完毕后将A、B两组鸭胚放到同一个孵化箱孵化并每天照蛋做好观察。等鸭胚孵化到24日龄开始进行解剖，观察并进行记录。鸭胚是横放着孵化，其中这24天孵化过程如下：（1）温度孵化温度为0-10d为38.3℃；11-19d为38.0℃；20-24d为37.7℃。（2）湿度0-10d相对湿度为70%；11-17d相对湿度为65%；18-24d相对湿度为60%；（3）翻蛋18 每2h翻蛋一次。2.4.2SPF鸡致病性实验2.4.2.1SPF鸡胚的孵化取55枚SPF鸡蛋放到孵化箱孵化，其中孵化过程如下：（1）1-7d温度为37.8℃；8-16d温度为37.8℃；17-19d温度为37.8℃；20-21d温度为37.2℃。每2h翻一次蛋。（2）1-7d湿度为60%；8-16d湿度为55%；17-19d湿度为65%；20-21d湿度为68%。（3）翻蛋：每2h翻一次蛋。（4）20d开始落盘并每天早上和晚上用喷壶给鸡蛋表面喷少些水软化蛋壳，以帮助小鸡啄壳。2.4.2.2动物分组将孵化出的54只SPF鸡在隔离器饲养1d。1日龄时随机解剖4只，观察内脏器官是否正常，并取内脏器官做PCR检测，检查健康情况。确定健康状况后，将剩下的50只随机分成两个组，实验组25只，对照组25只。2.4.2.3攻毒5.25实验组SPF鸡腿部肌肉注射0.3mL（0.3x10TCID50）CH-GD-12-2014病毒液，对照组SPF鸡腿部肌肉注射0.3mLDMEM培养液，随后将两组SPF鸡分到两个相同的隔离器，在相同的条件下饲养。2.4.2.4解剖观察分别在攻毒后的第3、7、14、21、30d时随机挑取实验组和对照组各3只SPF鸡颈动脉放血处死，并解剖。所有SPF鸡在解剖前观察外表是否有炎症等不良反应，然后打开腹腔、胸腔并观察肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等脏器的临床症状。采集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾、法氏囊、胸腺、小肠等样品将其分成两份，一份用于后续的病理切片制作，一份用于后期PCR检测。用于病理切片制作的那一份置于10%甲醛固定液中固定，进行HE染色制作病理切片，然后在显微镜下观察组织病变。用于PCR检测的那一份用采样袋装好并做好标记后马上放到-80℃冰箱保存。2.4.2.5病理切片制作用于制作切片的样品保存于浓度为10％的甲醛固定液中，并进行切片制作。制作19 切片的步骤如下：（1）洗涤和脱水材料经过固定后，流水冲洗6h，材料依次经过70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min（可在脱水机中自动完成）。（2）透明和透蜡与纯酒精、二甲苯等量混合15min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ则各30min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中透蜡各50-60min。（3）包埋用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，水平放在桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。（4）切片①将已经固定并修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15rad左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10μm。⑥一切调整好后便可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50rpm。⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。（5）展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。①切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。20 ③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。④另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。（6）脱蜡复水将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至蜡熔化。之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。（7）染色与水洗切片放入苏木精中染色约10-30min。用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。（8）分化与漂洗将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约两秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。（9）脱水Ⅰ与复染切片放入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。（10）脱水Ⅱ与透明将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。（11）封藏：中性树胶封存因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。2.4.2.6DNA提取取4.2.2.4步骤中用于PCR检测的样品约1-2g，加双抗溶液充分研磨，用移液枪将研磨液转移到离心管并保存于-80℃超低温冰箱，三冻三解后按OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA抽提。具体的抽提方法与2.2.2.1步骤一样。21 2.4.2.7组织器官PCR检测（一）引物设计根据本实验室高通量测序所得序列CH-GD-12-2014设计了两对特异性检测引物（见表2.4）送上海生物工程公司合成。合成的引物经简单离心，再用ddH2O溶解并稀释成100μM的溶液，置于-20℃保存备用。表2.4CH-GD-12-2014引物名称上下游引物（5`-3`）GD1R：CCTGACTTGACGACGGCTACF：GTGCTCCTTGTTGAGGTGTTTCTGD2R：TTGACGACGGCTACGCF：GTGCTCCTTGTTGAGGTGTTTCT（二）PCR扩增以各组织器官抽提的DNA样品为模板，扩增目标病毒DNA序列，PCR反应体系见表2.5。表2.5PCR反应体系成份体积模版DNA1μL2×PCRTaqStarMix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLddH2O8μLTotalvolume20µL注：PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环；72℃延伸10min；4℃forever。（三）PCR扩增产物的检测扩增后取10μLPCR产物，点样于1%琼脂糖凝胶孔（加有Goldview染液）上，22 以DNAMarkerDL2000作为参照物，电泳结束后在GDS-8000PC型凝胶成像系统观察扩增效果及进行分析拍照。2.4.3白鸭致病性实验2.4.3.1动物分组53只白鸭在隔离器饲养1d。1日龄时随机解剖3只，观察内脏器官是否正常，并取内脏器官做PCR检测，检查健康情况。确定健康状况后，将剩下的50只白鸭随机分成两个组，实验组25只，对照组25只。2.4.3.2攻毒5.25实验组白鸭腿部肌肉注射0.2mL（0.2x10TCID50）CH-GD-12-2014病毒液，对照组白鸭腿部肌肉注射0.2mLDMEM培养液。随后将两组白鸭分到两个相同的隔离器，在相同的条件下饲养。2.4.3.3解剖观察分别在攻毒后的第3、7、14、21、30d时随机挑取实验组和对照组各3只白鸭颈动脉放血处死，并解剖。所有白鸭在解剖前观察外表是否有炎症等不良反应，然后打开腹腔、胸腔并观察肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等脏器的临床症状。采集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾、法氏囊、胸腺、小肠等样品将其分成两份，一份用于后续的病理切片制作，一份用于后期PCR检测。用于病理切片制作的那一份置于10%甲醛固定液中固定，进行HE染色制作病理切片，然后在显微镜下观察组织病变。用于PCR检测的那一份用采样袋装好并做好标记后马上放到-80℃冰箱保存。2.4.3.4病理切片制作用于制作切片的样品保存于浓度为10％的甲醛固定液中，并进行切片制作。病理切片的制作方法和2.4.2.5步骤一样。2.4.3.5DNA的提取取4.2.3.3步骤中用于PCR检测的样品约1-2g，加双抗溶液充分研磨，用移液枪将研磨液转移到离心管并保存于-80℃超低温冰箱，三冻三解后按OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA抽提。具体的抽提方法与2.2.2.1步骤一样。2.4.3.6组织器官PCR检测引物设计、PCR扩增程序及检测步骤和2.4.2.7一样。23 2.4.4番鸭致病性实验2.4.4.1番鸭蛋的孵化取65枚受精番鸭胚放到孵化箱进行孵化。值得注意的是番鸭蛋的孵化与其他禽蛋气室向上竖直孵化的方法不同，番鸭蛋的孵化是平放着孵化。因为番鸭蛋在蛋盘上垂直放置，蛋中胚胎的发育受到影响，尿囊生长慢，不能在尖端合拢，或者即便合拢也不能将全部蛋白包住。这使胚胎不能充分利用蛋白，因而胚胎发育差，并且往往死亡。发现孵化后期胚胎死亡率特别高。所以平放孵化是番鸭蛋孵化的关键。具体孵化的相关事项如下：（1）温度孵化温度0-10d为38.3℃；11-19d为38.0℃；20-27d为37.7℃；28-30d为37.5℃；31-35d为37℃。（2）湿度0-10d相对湿度为70%；11-17d相对湿度为65%；18-25d相对湿度为60%；26-30d相对湿度70%；31-35d为75%。（3）翻蛋每2h翻蛋一次，孵化到31d开始落盘。（4）晾蛋番鸭蛋的油层相当牢固，孵化时不去除会影响孵化效果。番鸭蛋较大，散热量比较多。所以当孵化到15d时要开始晾蛋。15-19d，每天晾蛋一次，19-30d早晚各一次，晾蛋时以把蛋放到眼睑下感觉不到烫作为标准。每次晾蛋时用喷壶在鸭蛋表面喷上少许水帮助蛋降温和逐渐去除油层。由于小鸭的嘴比小鸡顿，到落盘时，每天用喷壶给鸭蛋喷水3次，降低蛋壳硬度以帮助小鸭啄壳。当遇到有些小鸭出壳困难时需要人工帮助小鸭出壳以提高孵化率。2.4.4.2动物分组将孵化出的番鸭中的53只放到隔离器饲养1d，1日龄时随机解剖3只，观察内脏器官是否正常，并取内脏器官做PCR检测，检查健康情况。确定健康状况后，将剩下的50只番鸭随机分成两个组，实验组25只，对照组25只。2.4.4.3攻毒5.25实验组番鸭腿部肌肉注射0.3mL（0.3x10TCID50）CH-GD-12-2014病毒液，对照组番鸭腿部肌肉注射0.3mLDMEM培养液，随后将两组番鸭分到两个相同的隔24 离器，在相同的条件下饲养。2.4.4.4解剖观察分别在攻毒后的第3、7、14、21、30d时随机挑取实验组和对照组各3只番鸭颈动脉放血处死，并解剖。所有番鸭在解剖前观察外表是否有炎症等不良反应，然后打开腹腔、胸腔并观察肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等脏器的临床症状。采集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾、法氏囊、胸腺、小肠等样品将其分成两份，一份用于后续的病理切片制作，一份用于后期PCR检测。用于病理切片制作的那一份置于10%甲醛固定液中固定，进行HE染色制作病理切片，然后在显微镜下观察组织病变。用于PCR检测的那一份用采样袋装好并做好标记后马上放到-80℃冰箱保存。2.4.4.5病理切片制作用于制作切片的样品保存于浓度为10％的甲醛固定液中，并进行切片制作。病理切片的制作步骤和2.4.2.5的步骤一样。2.4.4.6DNA的提取取2.4.3.3步骤中用于PCR检测的样品约1-2g，加双抗溶液充分研磨，用移液枪将研磨液转移到离心管并保存于-80℃超低温冰箱，三冻三解后按OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA抽提。具体的抽提方法与2.2.2.1步骤一样。2.4.4.7组织器官PCR检测引物设计、PCR扩增程序及检测步骤和2.4.2.7一样。2.4.5SPF绍兴麻鸭致病性实验2.4.5.1SPF绍兴麻鸭的孵化取60枚SPF绍兴麻鸭放到孵化箱孵化。SPF绍兴麻鸭的孵化方法采用的是哈尔滨兽医研究所提供的恒温孵化法。1-28d温度恒为37.5℃，1-26d湿度为60%，27-28d湿度为65%。每2h翻蛋一次。由于鸭蛋体积较大，到后面散热很多。孵化到第13d时，每天中午晾蛋一次。晾蛋的标准以放到眼睑不感觉到烫为标准。孵化到第18d时，每天早上和晚上各晾蛋一次。孵化到24d时，每天早上、中午和晚上晾蛋一次。孵化到27d时开始落盘，每天用喷壶给鸭蛋喷少许水两次，以软化蛋壳帮助小鸭孵化。当遇到有些小鸭出壳困难时需要人工帮助小鸭出壳以提高孵化率。25 2.4.5.2动物分组将孵化出的53只SPF绍兴麻鸭放到隔离器饲养1d。1日龄时随机解剖3只，观察内脏器官是否正常，并取内脏器官做PCR检测，检查健康情况。确定健康状况后，将剩下的50只SPF绍兴麻鸭随机分成两个组，实验组25只，对照组25只。2.4.5.3攻毒5.25实验组SPF绍兴麻鸭腿部肌肉注射0.3mL（0.3x10TCID50）CH-GD-12-2014病毒液，对照组SPF绍兴麻鸭腿部肌肉注射0.3mLDMEM培养液，随后将两组SPF绍兴麻鸭分到两个相同的隔离器，在相同的条件下饲养。2.4.5.4解剖观察分别在攻毒后的第3、7、14、21、30d时随机挑取实验组和对照组各3只SPF绍兴麻鸭颈动脉放血处死，并解剖。所有SPF绍兴麻鸭在解剖前观察外表是否有炎症等不良反应，然后打开腹腔、胸腔并观察肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等脏器的临床症状。采集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾、法氏囊、胸腺、小肠等样品将其分成两份，一份用于后续的病理切片制作，一份用于后期PCR检测。用于病理切片制作的那一份置于10%甲醛固定液中固定，进行HE染色制作病理切片，然后在显微镜下观察组织病变。用于PCR检测的那一份用采样袋装好并做好标记后马上放到-80℃冰箱保存。2.4.5.5病理切片制作用于制作切片的样品保存于浓度为10％的甲醛固定液中，并进行切片制作。病理切片的制作步骤和2.4.2.5的步骤一样。2.4.5.6DNA的提取取2.4.3.3步骤中用于PCR检测的样品约1-2g，加双抗溶液充分研磨，用移液枪将研磨液吸到离心管并保存于-80℃超低温冰箱，三冻三解后按OMEGA公司提供的病毒DNA抽取试剂盒使用说明书进行DNA抽提。具体的抽提方法与2.2.2.1步骤一样。2.4.5.7组织器官PCR检测引物设计、PCR扩增程序及检测步骤和2.4.2.7一样。2.5免疫保护试验2.5.1SPF绍兴麻鸭的孵化将50枚SPF绍兴麻鸭受精蛋放到孵化箱进行孵化。孵化步骤和注意事项和2.4..5.126 步骤一样。2.5.2一免将孵化出的43只SPF绍兴麻鸭放到隔离器饲养1d，1日龄时随机解剖3只，观察内脏器官是否正常，并取内脏器官做PCR检测，检查健康情况。确定健康状况后，将剩下的40只SPF绍兴麻鸭随机分成两个组，实验组20只，对照组20只。等小鸭长到10日龄时开始进行第一次免疫。实验组通过腿部肌肉注射入制备好的灭活疫苗300μL，对照组通过腿部肌肉注射入300μLDMEM培养液。其中灭活疫苗的制备方法如下：（1）灭活病毒液的制备：取病毒液若干，10000rpm离心后用孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤后取过滤液99.82mL，添加0.18mL甲醛溶液（甲醛终浓度为0.18%），然后37℃灭活24h，每0.5h摇晃一次。（2）水相制备：取96mL灭活病毒液，加入4mL4%吐温-80，振荡使混合充分。（3）油相制备：取94mL白油，加入2g2%硬脂酸铝和6mL6%司班-80，置电热炉上加热溶解至透明，冷却至室温备用。（4）灭活疫苗制备：将油相与水相按2：1的比例配置。乳化时先加油相，然后边摇动边加入水相（抗原），水相加完后，于干净的环境或SPF车间进行充分乳化（用乳化机震荡）。乳化前，在水相中添加双抗（青霉素和链霉素），2000单位/mL。（5）乳化效果检验：乳化结束后，取适量乳化疫苗在3000rpm离心10min，观察有无分层，如分层，则应继续乳化，直至不分层即可。然后取上层乳液，去掉下面少许乳化机留下的金属沉淀。最后进行分装标记并放到4℃保存备用。2.5.3二免等小鸭长到20日龄，即一免后10d进行第二次免疫。实验组通过腿部肌肉注射入制备好的灭活疫苗300μL，对照组通过腿部肌肉注射入300μLDMEM培养液.。其中灭活疫苗的制备方法和5.2.2步骤一致。2.5.4攻毒二免后第2d对鸭进行攻毒。通过腿部肌肉注射的方法对实验组和对照组每只SPF5.25绍兴麻鸭都注射300μLCH-GD-12-2014病毒液（0.3x10TCID50）。2.5.5采血分别在一免后第7d和攻毒后第3、7、14、21、28、35、42、50d通过颈动脉采血的方法用一次性注射器采取实验组鸭每只1.5mL血到高压过的两毫升离心管，做好27 标记后放到4℃冰箱过夜。第二d拿出离心管，3000rpm离心20min取上层血清到新的离心管并做好标记保存到-80℃冰箱以备后续抗体检测使用。2.5.6临床解剖观察分别在攻毒后到第3、7、14、21、28、35、42、50d时随机挑取实验组和对照组各3只SPF绍兴麻鸭颈动脉放血处死，并解剖。所有SPF绍兴麻鸭在解剖前观察外表是否有炎症等不良反应，然后打开腹腔、胸腔并观察肝脏、心脏、肌胃、腺胃、脾、肠、法氏囊、肾脏、肺脏、胸腺等脏器的临床症状。采集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾、法氏囊、胸腺、小肠等样品置于10%福尔马林固定液中固定，进行HE染色制作病理切片，然后在显微镜下观察组织病变。2.5.7病理切片制作病理切片的制作步骤和2.4.2.5的步骤一样。2.5.8抗体检测2.5.8.1病毒的纯化（1）病毒的大量培养：用DEF细胞大量繁殖病毒，反复冻融3次后，置于-80℃中保存备用。（2）病毒的灭活：细胞病毒液解冻后，4℃，10000rpm离心10min，取上清，采用0.38％甲醛，37℃灭活24h，。（3）蔗糖密度梯度离心纯化：在制备好的蔗糖梯度上加上一步得到的病毒浓缩液，4℃，30000rpm蔗糖密度梯度离心3h（蔗糖梯度：20%，30%，45%，60%）。在45%蔗糖带有明显白色区间出现。小心收集离心管中的每个区段，留待后面的检测。（4）脱糖：将收集到的45%蔗糖带溶液加在PBS上再次进行离心，4℃，22500rpm离心1h。弃上清将沉淀用1mLPBS溶解。可先用500μL进行第一次溶解，再用500μL进行第二次溶解）全部管溶成1mL。-80℃中保存备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。2.5.8.2ELISA操作程序用包被缓冲液将抗原做一定稀释，按100μL每孔加入酶标板中，置于4℃过夜，取出，弃包被液，用洗涤液洗板3次，每次浸泡1min，然后加入100μL/孔的封闭液，37℃反应2h。取出洗板（同上），将待检样品（血清）用血清稀释液稀释后，按100μL/孔加入酶标板，37℃反应60min。取出洗板（同上），按100μL每孔加入稀释好的酶标二抗，37℃反应60min。取出洗板（同上），按100μL每孔加入底物缓冲液，室温28 反应5～15min，按100μL每孔加入终止液，混匀，在酶标仪上测OD450吸光度值。记录结果，计算被检样品（P）和阴性标准品（N）的比值。结果判定按照P/N>2.1的样品判定为阳性；1.5＜P/N＜2.1的样品判定为可疑；P/N＜1.5的样品判定为阴性。2.5.8.3确定抗原抗体最佳工作浓度用棋盘滴定法，将CH-GD-12-2014全病毒用包被液稀释到不同浓度（100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL）取100μL加入酶标板中，4℃包被过夜，1％BSA封闭，将阳性血清、阴性血清作系列稀释（1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280），按ELISA步骤进行操作，读数后取阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N）最大所对应抗原、抗体的稀释浓度为最佳稀释度。2.5.8.4确定最佳酶标二抗工作浓度以前一步骤最适抗原浓度4℃包被过夜，1％BSA封闭，加入最适浓度标准阳性和阴性血清，将酶标二抗作系列稀释（1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：3000、1：5000、1：10000）按ELISA步骤操作，读数后取阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N）最大所对应酶标二抗的稀释度为最佳稀释度。2.5.8.5封闭液的选择以最适抗原浓度包被酶标板，按ELISA步骤操作，分别用1%BSA、5%脱脂奶粉和10％胎牛血清作为封闭液，以0.1%BSA、1%脱脂奶粉和5％胎牛血清作为稀释液，对三个不同样品进行分别三次测定OD450，对比ELISA试验结果，计算（P/N）值，选择最适的封闭液和稀释液。2.5.8.6抗体与酶标二抗最佳孵育时间的确定以最适抗原浓度包被酶标板，封闭好后加入阳性和阴性血清反应，按ELISA步骤操作，抗原抗体反应时间、抗原抗体复合物与酶标二抗反应时间分别以（30min，30min）、（60min，60min）、（90min，90min），同一样品进行反复三次的测定OD450，读数后取阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N），以P/N值最大确定最佳抗原抗体反应时间以及抗原抗体复合物与酶标二抗反应时间。2.5.8.7重复性实验随即抽取4份待检血清，同一条件进行6次重复检测，计算出变异系数（CV%），分析结果有无明显差异。2.5.8.8血清样品的检测用本实验建立的CH-GD-12-2014全病毒抗原-ELISA检测方法，检测采集于攻毒29 保护实验期间不同日龄的血清30 3实验结果与分析3.1病毒分离鉴定结果3.1.1病毒初步PCR鉴定结果根据NCBI上已公布的6种鸭病毒的序列设计引物检测病鸭肝脏病毒DNA结果显示：只有根据duckadenovirus2序列设计的引物有电泳条带，其他5对引物通过PCR后电泳都无条带，初步猜测该病毒可能为鸭腺病毒。电泳结果图如下：图3.1PCR鉴定结果注：M：DNAMarkerDL2000，1-6的引物分别为为根据Duckadenovirus2、Duckenteritisvirus、Muscovyduckparvovirus、DuckhepatitisBvirus、Duckhepatitisvirus、Duckreovirus序列所设计的引物。3.1.2病毒在DEF细胞上培养结果病毒在DEF细胞上盲传6代后，DEF细胞开始出现病变。攻毒24h后攻毒组DEF细胞开始出现核固缩，细胞不再是自由的张开生长状态而是开始收缩。对照组细胞则没有发生变化。攻毒48h后攻毒组DEF细胞继续收缩并开始出现葡萄串病变样，而对照组没有发生变化。攻毒96h后攻毒组DEF细胞开始裂解，只剩下零碎的细胞碎片。而对照组细胞还是自由的展开生长状态（见图3.2）。31 图3.2DEF细胞生长情况注：A、B、C分别为对照组生长24h、48h、96hDEF细胞；D、E、F分别为攻毒组生长24h、48h、96hDEF细胞。3.1.3进一步PCR结果病毒在细胞上培养抽提DNA后PCR结果如图3.3示，进一步确定该病毒为鸭腺病毒，也表明成功的从DEF细胞上培养了该病毒。图3.3PCR电泳结果注：M为DNAMarkerDL2000；1～5的引物为根据Duckadenovirus2序列设计的引物3.1.4电镜观察结果病毒经浓缩纯化后，在电镜下观察，可见病毒形状呈球形，大小为65-75nm，呈二十面体对称结构。32 3.4透射电子显微镜下的病毒粒子3.1.5高通量测序结果高通量测序结果表明：从DEF上分离的病毒全基因序列为43842bp，命名为CH-GD-12-2014。全序列可在NCBI检索到，检索号码为KR135164。该序列GC含量为47.14%，倒置末端重复序列（ITRs）为721bp，含有37个基因。该序列与GoAdV-4基因组十分相似，与AnaMarek的序列相似性为92.3%（见图3.5）。该序列缺乏ORF51，1C，54，拥有ORF55A和五个其他的独特的基因（ORF63-67），含有两个纤维基因。图3.5CH-GD-12-2014与其他禽腺病毒的同源性分析分析CH-GD-12-2014编码氨基酸的不同序列区并与鸭腺病毒2型GR株进行比较可以观察两株病毒的异同。通过分析显示虽然CH-GD-12-2014和鸭腺病毒2型GR株有较高的同源性，但是有一些关键基因却存在很大的差异（见表3.1）。比如，CH-GD-12-2014有fiber-1和fiber-2两个基因，而鸭腺病毒2型GR株只有1个fiber-1基因。33 表3.1CH-GD-12-2014和GR株基因组各个蛋白质编码序列的方向、位置和氨基酸aGeneStrandDAdV-3No.ofDAdV-2No.ofaa（CH-GD-12-2014）aa（GR）ORF1R1185-16491541185-1649154ORF52R1642-22562041642-2256204ORF2R2517-32722512517-3272251ORF14L3300-40042363300-400423614,711-14,71614,711-14,716ORF12L4026-49283024026-492830214711-1471614,711-14,716Iva2L4894-60813954894-6081395polL6065-10,09013416065-10,0901341pTPL10,092-11,89160110,092-11,89160114,711-1471614,711-14,71652KR11,917-13,02336811,917-13,023368PIIIaR13,007-14,69856313,007-14,698563IIIR14,729-16,30052314,729-16,309526PVIIR16,300-16,5578516,309-16,57588PXR16,589-17,12517816,616-17,155179PVIR17,178-17,88523517,208-17,921237hexonR17,920-20,73393717,956-20,778940proteasR20,745-21,35920420,787-21,401204eL21,428-22,75951221,466-22,788504DBP22,799-23,00522,828-23,019R23,029-25,85794223,043-25,874943100KR26,083-26,33019725,558-25,90319733K25,547-25,89226,088-26,335R25,547-26,14619925,558-26,15119722KR26,293-27,02424326,298-27,083261PVIIIL<27,041-27,25371<27,100-27,3171UR27,213-28,5924592698fiber-1R28,592-30,03448027,586-29,682fiber-2L30,027-30,70422522134 ORF22L30,707-31,58228029,686-30,351280ORF2032,629-32,64930,357-31,175AL31,507-32,46632632,276-32,29632632,629-32,64931,154-32,113ORF20L32,715-33,17917332,276-32,29617340,088-40,14432,362-32,826ORF56L33,192-33,59915439,720-39,77615440,088-40,14432,842-33,246ORF55L33,650-34,05115239,720-39,77615240,088-40,14433,297-33,698ORF55L34,074-35,79559239,720-39,776592A40,088-40,14433,721-35,442L35,802-39,446123339,720-39,7761228ORF1940,088-40,14435,449-39,078L40,508-41,12820639,720-39,776249ORF19R41,180-41,3024040,263-41,01290BR41,757-41,8794041,011-41,28340L41,953-42,1295841,649-41,77158ORF53L42,313-42,89719441,845-42,021194ORF63L42,873-43,0767042,205-42,78970ORF6442,756-42,968ORF67ORF66ORF65a注：R-rightward-transcribedstrandandL-leftward-transcribedstrand由表3.1的对比，我们可知，CH-GD-12-2014序列与AnaMerak的序列相似性较高，最大的区别是AnaMerak的GR株序列的fiber基因只有fiber-1，而CH-GD-12-2014序列的fiber基因有fiber-1和fiber-2。进化树分析：应用MEGA（5.0）分析软件，建立了基于多个腺病毒全基因序列、hexon基于序列的系统进化树。由全基因序列进化树图（图3.6）可知CH-GD-12-2014株和GR株同在最小的一分支并且都和GoAdV-4P29相近。他们虽然在禽腺病毒属，但是和禽腺病毒属的12个血清型却不同。以上结果表明CH-GD-12-2014株和GR株35 是禽腺病毒，但却不是之前已确认的12个血清型之一。都是新的腺病毒。由hexon基因序列进化树图（图3.7）可知，与鸭腺病毒2型GR株相比较，鸭腺病毒1型与CH-GD-12-2014株同源性更高。这表明CH-GD-12-2014株和GR株虽然都是鸭腺病毒，但却是有很大的区别的。图3.6全基因组进化树36 图3.7hexon基因序列进化树图3.2理化和生物学试验结果3.2.1血凝实验多次实验结果都是该病毒不对鸭红细胞和鸡红细胞产生血凝作用。所以CH-GD-12-2014不对鸭红细胞和鸡红细胞产生血凝作用。3.2.2TCID50实验TCID50结果见表3.237 表3.2TCID50试验结果病毒的稀释倍数细胞病变概率（%）010100-110100-21070-31055-41020-51010-6105-7105-8100-9100距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数=0.25lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=-4.25-4.25TCID50=10/0.1mL-4.25所以将该病毒稀释10接种100μL细胞可使50%的细胞发生病变，即1mL的5.25病毒液TCID50数为10。3.2.3理化实验理化试验结果显示CH-GD-12-2014耐酸不耐碱，对温度的敏感性不高。乙醚、丙酮、氯仿对CH-GD-12-2014的影响较小，紫外照射和甲醛可以使CH-GD-12-2014灭活。结果见表3.338 表3.3理化实验结果处理组TCID50/mL处理组TCID50/mL处理组TCID50/mL（pH）温度（℃）5.115.254.661103710乙醚105.255.254.832105010氯仿105.255.254.833106010丙酮105.255.254107010甲醛-5.255.255107510紫外-5.255.2561080105.255.1171085104.55.1181090103.85.1191095105.1110-100103.3致病性试验结果3.3.1番鸭胚致病性实验结果番鸭胚攻毒后出现不规律死亡，在攻毒后第4d、第11d和第14d分别有一枚攻毒的鸭胚死亡。对照组则没有鸭胚死亡。攻毒组番鸭胚的发病率为100%，攻毒后16d解剖可以发现主要的病理特征是形成不透明、易脆和增厚的绒毛尿囊膜。攻毒胚胎发育受阻，个体比对照组个体小（见图3.8）。图3.816d番鸭胚注：第一排为对照组，第二排为实验组39 3.3.2SPF鸡动致病性实验结果3.3.2.1SPF鸡的孵化结果55枚SPF鸡胚顺利孵出并存活的小鸡有54只，孵化率为98.18%。3.3.2.2临床症状及剖检观察1日龄攻毒后，对照组和实验组SPF鸡均表现正常。对攻毒后第3、7、14、21、30d的SPF鸡进行解剖时并没有发现明显的临床症状（见图3.9）。图3.9SPF鸡攻毒组各器官解剖图注：A、B和C分别为攻毒组SPF鸡攻毒7d的肝脏、心脏和肾脏；D、E和F分别为攻毒组SPF鸡攻毒14d的肝脏、心脏和肾脏。以上结果显示，实验期间攻毒组没有一只SPF鸡死亡，死亡率为0，也没发现明显的临床症状。3.3.2.3病理切片结果虽然攻毒组在解剖时没有明显的临床症状，但是组织器官切片却在攻毒组攻毒7d后看到明显的病变的情况。攻毒组在攻毒14d以后的切片却没有明显症状（见图3.10）。40 图3.10SPF鸡攻毒组各组织器官切片（400x）注：A为攻毒组SPF鸡攻毒7d肝脏切片，出现淤血；B为攻毒组SPF鸡攻毒7d心脏切片，纤维变性坏死，出血；C为为攻毒组SPF鸡攻毒7d肾脏切片，肾脏水肿，出血；D为攻毒组SPF鸡攻毒14d肝脏切片，没有明显的组织结构病变；E为攻毒组SPF鸡攻毒14d心脏切片，没有明显的组织结构病变；F为攻毒组SPF鸡攻毒14d肾脏切片，没有明显的组织结构病变。3.3.2.4组织器官PCR检测结果组织器官PCR检测以所抽提的各组织器官DNA为模板，扩增目标病毒基因片段，检测结果见表3.4。表3.4SPF鸡用CH-GD-12-2014攻毒后各组织PCR结果项目心脏肝脏脾脏肺肾脏胸腺法氏囊肠肌胃腺胃攻毒3d++--------攻毒7d++--------攻毒14d++--------攻毒21d++--------攻毒30d++--------注：+：代表项目检测结果为阳性；-：代表项目检测结果为阴性41 3.3.3白鸭致病性实验结果3.3.3.1临床症状及剖检观察1日龄攻毒后，对照组表现正常，攻毒组白鸭精神萎靡，少数双腿分叉无法站立，攻毒组有3只白鸭在攻毒第7d先后死亡（见图3.11）。图3.11攻毒组白鸭无法站立和病死图片在攻毒后的第3、7、14、21、30d解剖攻毒组时可以发现攻毒7d病死白鸭肝脏充血肿大，心脏表面有坏死出血点，肾脏充血肿大。对攻毒第3、14、21、30d白鸭进行解剖时可观察到出现血斑和肿大，心脏表面有黑色坏死结节，肾脏出现严重充血（见图3.12）。图3.12白鸭攻毒组各器官解剖图注：A为攻毒组白鸭攻毒7d肝脏，充血肿大；B为攻毒组白鸭攻毒7d心脏，表面有坏死出血点；C为攻毒组白鸭攻毒7d肾脏，充血肿大；D为攻毒组白鸭攻毒14d肝脏，肿大和出血；E为攻毒组白鸭攻毒14d心脏，表面有黑色坏死结节；F为攻毒组白鸭攻毒14d肾脏，严重出血。42 以上结果显示，实验期间总共死亡3只白鸭，死亡率超过10％，死亡率较高。致病器官主要发生在肝脏、心脏和肾脏，其中肝脏最为严重，其它器官肉眼没发现明显症状。3.3.3.2病理切片结果所取样品用10％的福尔马林固定液固定，制作切片并进行观察。从病理切片中我们可以看到肝脏淋巴细胞增多，中性粒细胞高于正常值并出现大量炎性细胞；心脏切片可见大量炎性细胞；肾脏出血（见图3.13）。图3.13白鸭攻毒组各组织器官切片（400x）注：A为攻毒组白鸭攻毒7d肝脏切片，淋巴细胞增多，中性粒细胞高于正常值并出现大量炎性细胞；B为攻毒组白鸭攻毒7d心脏切片，炎性细胞聚集；C为为攻毒组白鸭攻毒7d肾脏切片，出血。3.3.3.3组织器官PCR检测结果组织器官PCR检测以所抽提的各组织器官DNA为模板，扩增目标病毒基因片段，检测结果见表3.5。43 表3.5白鸭用CH-GD-12-2014攻毒后各组织PCR结果项目心脏肝脏脾脏肺肾脏胸腺法氏囊肠肌胃腺胃攻毒3d++--------攻毒7d++--------攻毒14d++--------攻毒21d++--------攻毒30d++--------注：+：代表项目检测结果为阳性；-：代表项目检测结果为阴性其中7日龄病死白鸭肝脏和心脏病毒DNAPCR电泳条带跟阳性对照一样，而其他日龄的则比较淡，见图3.14。图3.14PCR检测结果注：M：DL2000DNAMarker；1的DNA模板为CH-GD-12-2014；2的DNA模板为攻毒7d病死白鸭肝脏病毒DNA抽提物；3的DNA模板为攻毒3d白鸭肝脏病毒DNA抽提物3.3.4番鸭致病性实验结果3.3.4.1番鸭的孵化结果65枚番鸭胚中顺利孵化出并存活的小鸭为55只，孵化率为84.61%。3.3.4.2临床症状及剖检观察番鸭1日龄攻毒后，对照组番鸭表现正常，攻毒组番鸭在攻毒后7d解剖时可观察到肝脏充血肿大易脆，表面坏死结节；心脏表现为疏松积水，心脏上端有两个黑色赘生物，心尖出有黑色结节点；肾脏严重水肿充血。攻毒组番鸭在攻毒后14d解剖时44 可观察到肝脏表现为黄化现象并带有血点，心脏疏松积水，并且能看到血泡样肿大，肾脏充血肿大（见图3.15）。图3.15攻毒组番鸭各脏器剖检变化注：A为攻毒组番鸭攻毒7d肝脏，肝脏充血肿大易脆，表面有坏死结节；B为攻毒组番鸭攻毒7d心脏，疏松积水，心脏上端有两个黑色赘生物，心尖处有黑色坏死灶；C为攻毒组番鸭攻毒7d肾脏，严重水肿充血；D为攻毒组番鸭攻毒14d肝脏，黄化并带有出血点；E为攻毒组番鸭攻毒14d心脏，心包积水，有出血点和水泡；F为攻毒组番鸭攻毒14d肾脏，充血肿大。3.3.4.3病理切片观察将采集的各器官样品用10％的福尔马林固定液固定，制作切片及用显微镜进行观察，结果如下：45 图3.16攻毒组番鸭组织病理变化（400x）注：A为攻毒组番鸭攻毒7d肝脏，淤血-肝窦扩张，充满红细胞，肝细胞变性；B为攻毒组番鸭攻毒7d心脏，充血，血管周围水肿，肌纤维间隙增大；C为攻毒组番鸭攻毒7d肾脏，炎性细胞聚集；D为攻毒组番鸭攻毒14d肝脏，淤血，肝细胞脂肪变性；E为攻毒组番鸭攻毒14d心脏，肌纤维肿大变粗，少量炎性细胞浸润；F为攻毒组番鸭攻毒14d肾脏，出血，少量炎性细胞浸润。3.3.4.5组织器官PCR检测结果组织器官PCR检测以所抽提的各组织器官DNA为模板，扩增目标病毒基因片段，检测结果见表3.6。表3.6番鸭用CH-GD-12-2014攻毒后各组织PCR结果项目心脏肝脏脾脏肺肾脏胸腺法氏囊肠肌胃腺胃攻毒3d++--------攻毒7d++--------攻毒14d++--------攻毒21d++--------攻毒30d++--------注：+：代表项目检测结果为阳性；-：代表项目检测结果为阴性46 3.3.5SPF绍兴麻鸭致病性实验结果3.3.5.1SPF绍兴麻鸭的孵化结果60枚SPF绍兴麻鸭蛋中顺利孵化出并存活的小鸭为53只，孵化率为88.33%。图3.17是SPF绍兴麻鸭出雏后期拍摄的照片。图3.17SPF绍兴麻鸭出雏图3.3.5.2临床症状及剖检观察1日龄攻毒后，对照组SPF绍兴麻鸭表现正常，攻毒组SPF绍兴麻鸭精神萎靡、嗜睡。攻毒组有7只SPF绍兴麻鸭在攻毒后7d突然死亡，死亡率为28%。在攻毒后的第3、7、14、21、30d解剖攻毒组时可以发现攻毒组SPF绍兴麻鸭在攻毒第7d时肝脏肿大充血易脆并且黄化现象十分明显，心脏表现为疏松积水，在心脏上端有两个肿瘤样的血黑色赘生物；肾脏水肿充血。攻毒组SPF绍兴麻鸭在攻毒后第14、21d解剖时，可观察到肝脏表现为的黄化现象，心脏表现为心包积液现象，肾脏水肿充血（见图3.18）。47 图3.18攻毒组SPF绍兴麻鸭各脏器剖解变化注：A为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d肝脏，充血肿大易脆，黄化；B为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d心脏，心脏疏松积水，解剖过程中两个赘生物破裂，内容物溢出，心脏变畸形；C为为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d肾脏，充血肿大；D为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肝脏，黄化；E为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d心脏，心包积水，有出血点和水泡；F为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肾脏，充血肿大。攻毒组SPF绍兴麻鸭在攻毒后30d解剖时，可观察到包涵体肝炎现象，肝脏表面多处分布血黑色凝块。心脏变形，在心脏上端有两个肿瘤样的血黑色小包，肾脏表现为轻微充血（见图3.19）。48 图3.19攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒30d各脏器剖检变化注：A为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒30d肝脏和心脏正面剖检图，肝脏出血包涵体肝炎现象，肝脏表面多处分布血黑色赘生物，心脏变畸形，心脏上端有两个黑色赘生物；B为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒30d肝脏和心脏侧面剖检图；C和D为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒30d肝脏正面和背面图；E为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒30d肾脏。以上结果显示，实验期间总共死亡7只SPF绍兴麻鸭，死亡率为28％，死亡率高。致病器官主要发生在肝脏、心脏和肾脏，其中肝脏最为严重，其它器官肉眼没发现明显症状。并且随着日龄增长，主要致病器官病症越来越明显，越来越严重。3.3.5.3病理切片结果将解剖的器官用10％的福尔马林固定液固定，制作切片及观察，结果如下：49 图3.20攻毒组SPF绍兴麻鸭组织病理变化（400x）注：A为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d肝脏，淤血-肝窦扩张，充满红细胞，肝板结构破坏，部分肝细胞脂肪变性；B为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d心脏，心肌纤维水肿变粗，排列不齐，轻微充血；C为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒7d肾脏，轻微充血、水肿，肾细胞空泡变性；D为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肝脏，肝细胞脂肪变性严重；E为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d心脏，水肿充血，心包积水，肌纤维间隙增大；F为攻毒组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肾脏，充血、水肿，毛细血管充血，肾细胞空泡变性。3.3.5.5组织器官PCR检测结果组织器官PCR检测以所抽提的各组织器官DNA为模板，扩增目标病毒基因片段，检测结果见表3.7。表3.7SPF绍兴麻鸭用CH-GD-12-2014攻毒后各组织PCR结果项目心脏肝脏脾脏肺肾脏胸腺法氏囊肠肌胃腺胃攻毒3d++--------攻毒7d++--------攻毒14d++--------攻毒21d++--------攻毒30d++--------注：+：代表项目检测结果为阳性；-：代表项目检测结果为阴性50 3.4动物保护试验结果3.4.1SPF绍兴麻鸭孵化结果50枚SPF绍兴麻鸭蛋中顺利孵化出并存活的小鸭为43只，孵化率为86.00%。3.4.2临床症状及剖检观察2免第2d攻毒后，免疫组和未免疫组均没有SPF绍兴麻鸭死亡。分别在攻毒后到第3、7、14、21、28、35、42、50d时随机挑取攻毒免疫组和攻毒未免疫组组进行解剖。可发现攻毒免疫组没有什么临床症状。攻毒未免疫组SPF绍兴麻鸭表现为肝脏出现少数坏死灶；心脏轻微出血并出现黑色结节；肾脏表现为轻微充血（见图3.21和3.22）。图3.21SPF绍兴麻鸭攻毒14d各脏器剖检变化注：A、B、C分别为免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肝脏、心脏和肾脏，无明显病变症状；D为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肝脏，有少数坏死灶；E为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒14d心脏，轻微出血和黑色坏死结；F为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒14d肾脏，轻微充血。51 图3.22SPF绍兴麻鸭攻毒422d各脏器剖检变化注：A、B、C分别为免疫组SPPF绍兴麻鸭攻毒42d肝脏脏、心脏和肾脏，无明显病变症状；D为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d肝脏，有少数坏死灶；E为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d心脏，轻微出血和黑色坏死结；F为未未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒攻42d肾脏脏，轻微充血血。3.4.3病理切片结结果将解剖的器官用10％的的福尔马林固定液固定，制作切片并在显微镜下观察，结果如下：52 图3.23未免疫组SPF绍兴麻鸭组织病理变化（400x）注：A、B、C分别为免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d肝脏、心脏和肾脏，无明显病变症状；D为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d肝脏，出血和炎性细胞聚集；E为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d心脏，炎性细胞聚集；F为未免疫组SPF绍兴麻鸭攻毒42d肾脏，轻微充血。3.4.4血清抗体检测结果3.4.4.1抗原抗体最佳工作浓度的确定采用棋盘滴定法，根据阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N）最大原则确定抗原、抗体最佳稀释度，试验结果表明，CH-GD-12-2014全病毒抗原最佳稀释度为1：20，最佳包被浓度为50μg/mL；抗体最佳稀释度为1：640。如表3.8所示。53 表3.8全病毒抗原抗体最佳稀释度抗体稀抗原浓度（μg/mL）释倍数100502512.56.253.1251：404.965.024.925.015.134.971：805.014.975.105.185.155.091：1605.105.255.445.075.205.141：3205.295.335.215.165.155.101：6405.435.565.225.145.055.071：12805.285.265.125.165.035.013.4.4.2最佳酶标二抗工作浓度的确定将抗原以最适浓度包被，加入最佳稀释度的标准阳性血清，按ELISA步骤操作，将酶标二抗作系列稀释（1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：3000、1：5000、1：10000）实验结果表明，当二抗以1：500倍稀释时阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N）最大即为酶标二抗最佳稀释度。具体结果如图3.24所示。图3.24最佳酶标二抗工作浓度3.4.4.3最佳封闭液的选择对三个不同样品进行ELISA检测，分别用1%BSA、5%脱脂奶粉和10％胎牛血清作为封闭液，以0.1%BSA、1%脱脂奶粉和5％胎牛血清作为稀释液，对同一样品进行反复三次测定OD450，对比ELISA试验结果，计算P/N值，以P/N值最大的为最54 佳封闭液。结果表明以1%BSA/PBS封闭、0.1%BSA/PBS作为抗体稀释液时效果较好。具体结果如图3.25所示。图3.25最佳封闭液的确定3.4.4.4抗体与酶标二抗最佳孵育时间的确定进行抗体（一抗）与酶标二抗孵育时间确定，同一样品进行反复三次的测定OD450，读数后取阳性OD450与阴性OD450的比值（P/N），根据（P/N）值最大原则确定最佳抗原抗体反应时间以及抗原抗体复合物与酶标二抗反应时间。结果如表3.9，抗体与酶标二抗的最佳孵育时间分别为60min与60min。表3.9全病毒蛋白与抗体、酶标二抗最佳孵育时间的确定（P/N）值反应时间血清1血清2血清330min、30min5.635.555.5860min、60min5.865.685.7390min、90min5.235.365.393.4.4.5重复性实验其它条件相同情况下，分别取4份待检的猪血清在同一条件进行6次重复检测，求出变异系数（CV%），其结果如下表3.10所示。4份血清的变异系数最大为3.0%，结果表明CH-GD-12-2014全病毒抗原-ELISA方法重复性良好。55 表3.10批内变异系数检测值OD450批内变异系血清平均数123456OD450（CV%）样品血清11.9161.9221.9411.9031.9381.9781.9333.0％血清21.8291.8181.8541.8251.7971.8211.8241.0％血清31.8471.8231.8421.7861.8151.8271.8231.4％血清41.6591.6011.6541.6491.6701.6971.6551.9％3.4.4.6血清样品的检测用本实验建立的CH-GD-12-2014全病毒抗原-ELISA检测方法，检测采集不同日龄的几份血清，检测结果见表3.11。表3.11血清检测结果（P/N）值日龄血清1血清2血清3血清4血清5血清61免8d1.221.41.391.351.311.262免4d2.872.912.142.253.12.922免14d4.134.094.253.544.234.39免疫攻毒7d5.295.145.314.975.434.86免疫攻毒14d5.765.865.975.315.645.41免疫攻毒21d5.45.195.035.215.265.33免疫攻毒35d5.375.114.995.17--免疫攻毒42d5.215.07----未免疫攻毒21d2.132.321.211.51--未免疫攻毒35d2.142.211.161.52--未免疫攻毒42d2.191.24----56 4讨论4.1分离鉴定结果和序列分析在本研究中可以发现攻毒24h细胞收缩变圆，细胞开始聚集，细胞界限开始变模糊，48h后细胞聚堆呈葡萄状病变，96h后细胞大多数开始脱落降解。该病变过程与禽腺病毒在细胞上的病变过程很相似（李梅等，1997）。从以上细胞的病变过程，我们可以推测该病毒首先对细胞核产生作用，随后对细胞质产生作用，使细胞出现半空泡现象，最后使细胞完全降解。病毒液得以从细胞质释放出来并进行下一轮的复制。腺病毒为线状双股DNA病毒，无囊膜，呈二十面体对称，中等大小的病毒。腺病毒包括240个非顶体壳粒（六邻体）和12个顶体壳粒（五邻体基底），六邻体是腺病毒主要的衣壳蛋白（Ganeshetal.,2002；Kajanetal.,2011）。透射电镜结果图所显示的病毒粒子的微观结果与腺病毒的形状完全一致。关于鸭新型腺病毒的研究从1982年就开始了，但由于病毒序列的缺失，使研究无法顺利展开（Bouquetetal.,1982）。鸭腺病毒2型从1977年爆发到2014年全基因序列才全部出来，历时弥久（Mareketal.,2014）。由于没有序列，对病毒的分类和命名没有依据，导致研究一度无法向前。本研究和AnaMarek都通过高通量测序获得了新型鸭腺病毒的全序列，这使鸭腺病毒的研究更进了一步。我们有理由相信随着高通量测序的进一步广泛运用，各种动植物，微生物，乃至病毒的研究将得到空前的丰富。我们比对了CH-GD-12-2014和其他已知序列的腺病毒的同源性，与GR株的同源性最大为92.3%，接下来的是GoAdV-4P29（JF510462）为60%。这些结果加深了我们对这些病毒基因相似性之间的理解。CH-GD-12-2014株和GR株最有意义的不同点是CH-GD-12-2014株有fiber-1和fiber-2两个基因，而GR株只有一个fiber基因。Fiber-1基因对病毒在体内生物学表现至关重要，缺失fiber-1后会造成病毒产量下降，导致柯萨奇病毒和腺病毒受体（coxsackie/adenovirusreceptor，CAV）的特异性转导作用下降，使病毒只能感染禽类细胞，不能感染哺乳动物类细胞；fiber-2则对病毒增殖、组装或扩散的某个阶段是必需的，缺失fiber-2不能产生病毒粒子。而在只有fiber-1的病毒中，fiber-1相当于拥有fiber-1和fiber-2的病毒中的fiber-2，换句话说就是只有fiber-1的病毒其功能相当于两个都有的病毒中的fiber-2的功能（Hessetal.,1995）。先前研究表明纤维蛋白是参与病毒进入宿主细胞外壳的重要组成部分。病毒57 的毒力变化与fiber基因相关（Grgicetal.,2011；Pallisteretal.,1996）。所有感染力强的禽腺病毒都被检测到从基底伸出两个fiber基因（Gelderblometal.,1982）。这也就是说，CH-GD-12-2014株比GR株的感染宿主范围要大，感染力要强。CH-GD-12-2014株和鸭腺病毒2型GR株虽然同属禽腺病毒上的同一小分支，但两者还是有所不同的。进一步分析显示CH-GD-12-2014的hexon氨基酸序列与GR株和GoAdV-4株只有60%和58.6%的相似性。Hexon进化树进一步显示，相对于鸭腺病毒2型GR株，CH-GD-12-2014与鸭腺病毒1型的同源性更高。如果CH-GD-12-2014和GR株同是鸭腺病毒2型，那么应该和GR株一样只有一个fiber基因并且关键基因hexon和GR株的相似性应该远大于60%，但是hexon基因同源性分析表明CH-GD-12-2014与鸭腺病毒1型最接近。所以以上结果充分表明CH-GD-12-2014不是鸭腺病毒2型，是一株新型的鸭腺病毒，将之命名为鸭腺病毒3型（Duckadenovirus-3）。4.2病毒理化和生物学试验结果分析大量的研究显示禽腺病毒Ⅰ群病毒能够凝集大鼠红细胞，而不能凝集禽类的红细胞，一部分毒株可凝集绵羊红细胞；Ⅱ群禽腺病毒则无血凝性报道；Ⅲ群禽腺病毒EDSV可以凝集鸡、鸭、鸽、鹅、火鸡等禽类的红细胞（俞乃胜等，2002；周斌等，2005）。由全基因组进化树等可知，CH-GD-12-2014属于1群禽腺病毒。所以正如血凝实验结果显示CH-GD-12-2014对鸡和鸭红细胞等禽类红细胞不具有凝集作用。5.25TCID50试验结果显示1mLCH-GD-12-2014病毒液的TCID50数为10。病毒粒子的病毒效价不低，具有较高的致病力（LaBarreetal.,2001；李梅等，1997）。由于没有囊膜，所以禽腺病毒对外界环境抵抗力比较强，对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酚和乙酸均有抵抗力，可耐受pH3-9，在1：1000浓度甲醛中可被灭活（Dimitrovetal.,1979；刘东等，2015；刘长明等，1999）。理化特性实验表明CH-GD-12-2014对乙醚、氯仿、丙酮具有抵抗力，甲醛可使其灭活等特性与禽腺病毒一致。但CH-GD-12-2014对温度和酸碱度的耐受力更强。100摄氏度水浴1h病毒的活性依然很高。在pH=1的环境下作用1h效价基本不下降。这也表明了CH-GD-12-2014比其他禽腺病毒具有更强的外界抵抗能力。这必须引起我们的重视！CH-GD-12-2014耐酸不耐碱，可以通过提高pH值来杀死该病毒，但由于pH值要达到10病毒才会死亡，这会影响到动物和生存环境。所以处理该病毒较好的方法就是紫外照射或用甲醛处理，这为后期制备疫苗提供依据。58 4.3致病性试验结果分析病毒及细菌在自然界中广泛存在，只要机体免疫力下降就可能侵入机体引发疾病，并且在自然条件下以混合感染和继发感染为特征。除不同科、种的病毒发生混合感染外，不同血清型病毒也有发生混合感染的可能（董金才，1989）。再加上饲养管理条件和解剖操作过程的一些不注意的问题等都可能导致相关病症出现。由于以上原因，实验过程中需要排除自然感染及其他操作的失误可能。因此，在本实验中，我们在做每一种动物的致病性实验之前都会通过解剖1日龄的动物和PCR检测的办法初步确定实验动物健康，并设定等数量的对照组。对攻毒组动物每一个体注射0.3mLCH-GD-12-2014病毒液的同时也对对照组动物每个个体注射0.3mLDMEM培养液。隔离室及隔离器等器具在饲养动物前一周彻底清洗消毒。饲养过程的水和饲料等进行高压排除其他因素的感染。并且定时定量定员饲喂，避免动物应激，确保实验动物不受外界病毒病菌及环境的影响，有效排除其他因素的影响。禽腺病毒可以通过垂直传播和水平传播（Gunesetal.,2012；Kajanetal.,2013）可以直接或者间接地通过饲料、饮水和粪便排泄物等传播（高桂超，2011），本实验曾考虑通过点眼滴鼻的方法等来感染实验动物，但由于考虑到CH-GD-12-2014的TCID50并不是特别高，为了确保致病性实验结果，采用了腿部肌肉注射的方式。当然后期我们也可以尝试点眼滴鼻等感染方法。番鸭胚攻毒后出现不规律死亡，在攻毒后第4d、第11d和第14d分别有一枚攻毒的鸭胚死亡。攻毒组鸭胚解剖的主要病理特征是形成不透明、易脆和增厚的绒毛尿囊膜，胚胎发育受阻，个体比对照组个体小。这些症状都符合禽腺病毒对胚胎的致病性情况（Alemneshetal.,2012；Bogomolovaetal.,1974）。禽蛋的孵化对温度和湿度在不同时期有不同的要求，对孵化的条件也要一定的要求（戴有理，2003；何美联，1988）。而相对于鸡蛋的孵化（李新华等，2004），鸭蛋的孵化需要注意更多的事项，特别是番鸭胚的孵化。番鸭蛋的孵化与其他禽蛋气室向上竖直孵化的方法不同，番鸭蛋的孵化是平放着孵化。因为番鸭蛋在蛋盘上垂直放置，蛋中胚胎的发育受到影响，尿囊生长慢，不能在尖端合拢，或者即便合拢也不能将全部蛋白包住。这使胚胎不能充分利用蛋白，因而胚胎发育差，并且往往死亡。发现孵化后期胚胎死亡率特别高。所以平放孵化是番鸭蛋孵化的关键。番鸭蛋的油层相当牢固，孵化时不去除会影响孵化效果。番鸭蛋较大，散热量比较多。所以孵化到一定时间晾蛋喷水是非常关键的（廖纪朝等，1984；张雪松等，2005；朱必龙等，2009）。59 本研究在遵循以上操作后，番鸭蛋的孵化率为84.61%。虽然处于现阶段番鸭孵化的平均水平，但是与其他禽蛋的孵化率相比还是低。所以，运用孵化过程组合预测研究或者物理学、生理学方面等方法（戴有理，2003；周国雄等，2012）提高番鸭的孵化率是非常有必要的。禽腺病毒是一群高度多样化能引起家禽生产各种各样问题的病原体（Balamuruganetal.,2004）。第一株禽腺病毒是Olson从鹌鹑分离到的（OLSON,1951）。禽腺病毒根据不同群特异性抗原分为3个群。Ⅰ群禽腺病毒有12个血清型，包含有鸡、火鸡、鹅和鸭（KAWAMURAetal.,1964；McFerranetal.,1975；Zsaketal.,1984）。最为常见的临床症状有心包积水综合征、包涵体肝炎和支气管炎（Dutta,1975；Guyetal.,1997；Jadhaoetal.,2003）。Ⅱ群禽腺病毒可以引起火鸡出血性肠炎大理石脾病。Ⅲ群禽腺病毒是与减蛋综合征有关的一类病毒。关于禽腺病毒的研究很多都涉及心包积水综合征和包涵体肝炎等症状。心包积水综合征自1987年第一次在巴基斯坦（Anjumetal.,1989）报道以来，伊拉克、科威特、印度、墨西哥、厄瓜多尔、秘鲁、智利、韩国和日本等也相继进行了报道（Abdul-Azizetal.,1991；Abdul-Azizetal.,1995；Abeetal.,1998；Afzaletal.,1991；Chioccaetal.,1996；Dahiyaetal.,2002；Kimetal.,2008）。很多禽腺病毒在引起心包积水综合征也伴随着包涵体肝炎症状（Mazaherietal.,1998；Mittaletal.,2014；Toroetal.,2002）。本研究以SPF鸡、白鸭、番鸭、SPF绍兴麻鸭为模型研究CH-GD-12-2014对禽类的致病性。实验结果表明，该病毒对SPF鸡、白鸭、番鸭、SPF绍兴麻鸭致病程度虽然有差异，但在整体上都是一致的。主要的致病组织和器官都是肝脏、心脏和肾脏，都以肝脏致病性最为明显。SPF鸡虽然临床解剖没有观察到明显的症状，但攻毒第7d的病理切片却显示了相关的病变情况。而攻毒14d后的病理切片却没有显示明显的症状。这与宿主的免疫器官有关。禽腺病毒绝大部分是隐性传染，不引起明显的临床症状。腺病毒在动物体内复制，很大程度上受宿主免疫应答的调控（王小辉，2008）。所以SPF鸡攻毒后病毒虽然在鸡体内复制，但临床解剖却观察不到明显的症状。而白鸭、番鸭和SPF绍兴麻鸭感染CH-GD-12-2014后临床特征明显。其中白鸭和番鸭攻毒第7d各有3只和7只出现暴死现象。这是由于禽腺病毒虽然平时在动物体内复制不导致动物死亡，但一旦条件符合就会迅速其作用导致动物死亡，在临床上表现为急性病型。研究中我们可以发现感染的动物表现为精神萎靡、嗜睡。在动物体幼龄阶段发病表现为急性死亡。在生产上如果有动物体出现以上类似的现象便可初步判定感染了鸭60 腺病毒。解剖时要是能发现相似症状便可进一步做出判断。这为该病的诊断提供了初步的方法。由与本病除了垂直传播外，也可以水平传播，所以一旦发现病禽应立即淘汰并做无害化处理。本研究中出现死亡的动物都在动物抵抗力较弱的幼龄阶段。相关研究也表明禽腺病毒的感染与动物体的抵抗能力相关。所以增强动物体的抵抗能力可以有效的抵抗本病感染和防止继发性细菌性疾病。在饲喂动物的过程中可以添加维生素K及微量元素如铁、铜、钴等，也可以添加相应的提高免疫力的中药颗粒制剂和抗感染的化学药物。同时加强对禽流感、鸭腺联病毒、新城疫等疾病的控制，保护动物体的抵抗力也是相当重要的措施。当然加强饲养管理，做好鸡舍内部的温度、湿度、通风及环境卫生管理，创造良好的饲养环境，最大限度降低应激也是非常关键的防控措施。4.4动物保护试验结果分析腺病毒在动物体内复制，很大程度上受宿主免疫应答的调控（王小辉，2008）。病毒进入动物体内刺激动物体，动物体通过免疫反应抵抗病毒，并产生一定量的抗体。当外界环境发生改变或者动物遭受疾病时，机体的抵抗力下降，病毒开始发挥作用使动物发病。本次试验通过ELSIA检测可以发现实验组鸭在一免和二免4d时抗体很低，甚至为阴性。这是因为灭活苗刺激机体产生抗体的时间较长，为1-2周。这与灭活苗抗体的产生规律相符（戴红安等，2007；段二珍等，2011；李坚，2005）。ELSIA检测除了显示了抗体的产生规律外，也显示未免疫组也有个别个体产生少量抗体。由此我们可以推测CH-GD-12-2014进入机体后，机体通过免疫反应可以产生少量抗体。动物体与病毒存在一定的竞争机制。当外界环境改变或机体免疫力下降，病毒便开始发挥作用，使动物体产生明显的临床症状。致病性实验的结果显示CH-GD-12-2014能导致30日龄内的动物产生明显的临床的症状甚至死亡。这是由于幼龄时期动物体的抵抗力相对较弱，抵挡不住病毒的入侵。但当动物体日龄增长时抵抗力增强，对病毒具有一定的抵抗力。病毒对其没有明显的临床症状。免疫实验中未免疫组鸭在攻毒时已经是35日龄了，对病毒具有一定的抵抗作用，所以攻毒后没有出现死亡，只表现出轻微的临床症状，只能在病理切片方面看到一定的病变情况。而免疫组实验则没有表现出相应的临床症状，且ELSIA实验也表明免疫组的鸭都有抗体。所以本次免疫保护试验比较成功。本实验建立的ELISA方法具有较高的特异性、较好的稳定性和重复性，可以用于临床监测新型鸭腺病毒抗体水平及血清学流行病学调查，对检测鸭新型腺病毒具有参61 考意义，有望成为良好的试剂盒。由于目前市面上未出现商品化检测ELISA试剂盒，因此本次实验建立的ELISA方法暂时还不能与商品试剂盒的实验结果做对比，检测的血清数量有限，因而要成为商品化的试剂盒，还需进一步的深入研究和标准化工作。另外，由于CH-GD-12-2014对幼龄动物和胚胎的致病性更加明显，而灭活疫苗一般在注射后一到两周后起作用。因此进一步的疫苗实验是有必要的。下一步研究计划，我们将通过给开产前的母鸭注射疫苗，研究疫苗通过母源抗体对幼鸭的保护作用来进一步验证疫苗的作用。并通过大量临床血清样品的检测，从而来验证本试验研究建立的间接ELISA方法的特异性、稳定性和重复性。62 5总结5.1本研究成功分离到国内外第一株鸭腺病毒3型病毒CH-GD-12-2014。CH-GD-12-2014对鸭和鸡的红细胞不产生血凝作用；CH-GD-12-2014耐酸不耐碱，对温度的敏感性不高；乙醚、丙酮、氯仿对其影响较小，紫外照射和甲醛可以使之灭活。5.2CH-GD-12-2014对SPF鸡、白鸭、番鸭、SPF绍兴麻鸭等都具有致病性作用，且感染率为100%，主要致病器官是肝脏、心脏和肾脏。5.3本次灭活疫苗试验能刺激动物体产生一定量的抗体，对动物体起到一定的保护作用。63 致谢一转眼，两年的研究生生活悄然成为过去。这一路走来充满了太多的坎坷与欢笑，而留给我更多的是幸福与感恩，这也必将是我人生中难得的宝贵财富。本论文是在导师钟仰进教授和谢青梅教授悉心指导和亲切关怀下完成的。感谢两位恩师在学习与生活中给予我无微不至的关心和帮助。感谢两位老师在我的成长过程中倾注了大量的时间和心血，使我不断成长和进步。两年的学习生活中，两位导师渊博的专业知识，勤奋忘我的工作精神，积极豁达的人生态度，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力给我的人生打下了深刻的烙印。两位导师不仅教会了我如何治学做科研，更教会了我待人接物、为人处世的道理，让我受益终身。我深深的感受到能够成为二位老师的学生是我人生中最正确的选择和最大的幸运。在此向两位恩师致以崇高的敬意和衷心的感谢！衷心感谢团队德高望重的毕英佐研究员。毕老师平易近人，和蔼可亲，关心团队每一位学生的成长，让我们时刻感受大家庭般的温暖。毕老师的谆谆教导让我们明白了做人做事要外方内圆，做事要踏踏实实，对人要诚恳大度，对生活要永远保持一颗感恩的心。感谢家禽研究室马静云副教授、陈锋副研究员、孙宝丽副教授，蔺文成副教授和陈伟国老师在学习和生活上给予的大力指导及无私帮助！感谢家禽研究室曹永长教授、舒鼎铭教授、张辉华教授、张祥斌高级畜牧师、刘大才研究员和薛春宜副教授在学习和生活中给予的指导和帮助。感谢实验室管理员张晓琪老师在实验及生活上的帮助。感谢在论文完成过程中给予帮助的师兄师姐及同门：严专强、王伟山、李鸿鑫师兄、雍建法、李广伟、李胜鹏、廖昌韬、曾志良、陈飞洋、封柯宇、吴波良、申翰钦、周锦龙、赵晓亚、胡金枝、李昕键、申晓晨、刘晓琳、戴振凯、苏晓娜、伍绮文、张凯、伍子娴、李贞明、周科、黎鸿彬、方申辉、严一铭、麦凯杰、黄建飞、陆飘飘、白杨、冯嘉琪、雷小亚、吴彻、陈桂华、蔡迪、慈晓通和周玲等。特别感谢张新珩师姐和刘洋师姐在实验中给予的极大的帮助。特别感谢杨亦文、李卓勍、李倩雯、黄亚婷、邓敏在实验中给予的帮助。特别感谢我的舍友胡小超和范锦戴的支持和帮助。感谢我的家人一直以来给我的支持和鼓励。感谢各位院系领导、各位评审及答辩委员老师！64 参考文献戴红安,刘开武,陶淑珍,等.重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1型,Re-1株)抗体产生规律试验报告[J].湖北畜牧兽医,2007(01):8-9.戴有理.禽蛋孵化常数[J].中国家禽,2003(03):32-33.戴有理.孵化的物理学与生理学[J].中国家禽,2003(03):33-38.戴志红,谢磊,赵耘.腺病毒的生物学特性[J].中国兽药杂志,2007(02):36-39.董金才.动物病毒的混合感染[J].中国畜禽传染病,1989(Z1):124-128.段二珍,赵琳,陈静,等.PRRSV灭活抗原免疫接种后抗主要结构蛋白抗体的产生规律研究[J].免疫学杂志,2011(03):234-238.冯涛.鸭腺病毒感染的诊断和防治[J].山东畜牧兽医,2006(05):46.高桂超.禽腺病毒感染的防控[J].畜牧与饲料科学,2011(11):112-113.国纪垒.I群禽腺病毒山东株的分离鉴定及其致病性研究[D].山东农业大学,2012.何美联.各种禽蛋孵化期温度、湿度表[J].畜牧兽医科技,1988(04):48.贺小英.利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基（hTERT）制备牛乳腺细胞体外模型的研究[D].西北农林科技大学,2011.黄庚明,辛朝安,孔德迎.禽腺病毒的分子生物学研究进展[J].中国兽医科技,1996(08):20-22.金天明,武迎红.腺病毒及腺病毒载体的研究进展[J].天津农学院学报,2007(02):48-51.李坚.新型H_5N_1亚型禽流感灭活疫苗对家鸭的免疫原性研究[D].南京农业大学,2005.李梅,李永明,吴彤,等.禽腺病毒细胞病变观察和半数组织感染量测定[J].贵州农学院学报,1997(01):17-21.李新华,王春玲,黄中利.SPF鸡孵化技术[J].山东家禽,2004(09):8-10.廖纪朝.番鸭蛋的孵化特点[J].国外畜牧科技,1984(03):19-20.刘东,刘红祥,于静,等.Ⅰ亚群腺病毒在我国鸡群的流行病学调查[J].中国家禽,2015(15):70-73.刘根梅,陈瑞爱,罗满林.腺病毒载体的研究进展[J].广东农业科学,2010(04):188-190.刘尚高,徐镔蕊,甘孟侯,等.鸭腺病毒感染的诊断和防制[J].中国兽医科技,1996(08):31.刘长明,王端,张洪英,等.犬瘟热、猫细小病毒、犬腺病毒弱毒株的理化特性及生物学试验[J].中国预防兽医学报,1999(02):10-13.王小辉.Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[D].扬州大学,2008.俞乃胜,李文贵,韦剑珊,等.鹌鹑腺病毒的分离及病原特性的研究[J].畜牧兽医学报,2002(03):271-275.张科.重组禽腺病毒JS-eGFP的生物学特性与致病性研究[D].扬州大学,2005.张明明.Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建[D].扬州大学,2008.张雪松,黄晓红.孵化番鸭有新法[J].农村实用技术与信息,2005(04):21-22.65 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