鸭2型腺病毒的分离鉴定及主要结构蛋白基因的序列分析

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学校代码：10564学号：2013202802分类号：S855.3密级：硕士学位论文鸭2型腺病毒的分离鉴定及主要结构蛋白基因的序列分析陈亮指导教师：王林川教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：魏文康研究员中国·广州2016年12月I 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南农业大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用本授权书。□不保密。学位论文全文电子版提交后：□同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。(请在以上相应方框内打“√”)本人签名：日期：导师签名：日期：III 摘要2015年底广东惠州部分鸭场发生以肝脏和脾脏肿大、出血为主要症状的疑似“鸭肝病”疫情，本研究针对此次疫情进行了病原分离鉴定、生物学特性研究及主要结构蛋白基因序列分析，以期为该疫情的防控提供理论依据。通过接种11日龄番鸭胚，从发病鸭群病料中分离到三株未知病毒X-1、Y-1、Z-1，经PCR鉴定，均为鸭2型腺病毒（DAdV-2）。选取X-1株作为研究对象，采用第六代毒进行鸭胚致病性、致细胞病变、理化特性等病原特性研究。结果表明：鸭胚死亡时间主要集中在36~72小时，胚体全身弥漫性出血，ELD50为6.3110/ml。不凝集鸡、鸭红细胞，在鸭胚成纤维细胞（MDEF）上可致细胞变圆，折光性增强等病变。试验参照GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）基因组序列，设计5对特异性测序引物，对X-1株五邻体（penton）、六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）基因分段克隆测序，测序结果应用DNAStar7.0及MEGA7.0软件进行序列比较分析。结果表明：分离株hexon基因全长2,814bp，编码937个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）相似性最高，为100%，与基因库仅有的另两株GR毒株（两者hexon基因序列片段相同，登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为76.6%和86%。分离株penton基因全长1,572bp，编码523个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）和GR株（登录号：KJ469653.1）相似性均为100%，与另一株GR株（登录号：NC_024486.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为83.7%和90%。与GoAdv-4（登录号：NC_017979.1）核苷酸、氨基酸相似性则分别为70.2%和75%。fiber基因全长2,823bp，编码939个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）相似性最高为100%，与另两株GR株（登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸相似性均为45.8%。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因相似性较低。本研究结果补充和丰富了鸭2型腺病毒的基因组信息数据，以期为深入研究该毒株的遗传和变异及其与生物学特性的关系奠定基础。关键字：鸭2型腺病毒；分离鉴定；结构蛋白；序列分析I IsolationandIdentificationofaDuckAdenovirus2anditsPrimaryStructuralProteinGeneCloningandAnalysisChenLiang(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract：Attheendof2015,aepidemicwithliverandspleenhemorrhagewereoutbreakedinsomeduckeryinHuizhoucity,Guangdongprovince.Inresponsetothisdisease,thepathogenwasisolatedandidentificated,furthermore,biologicalcharacteristicsandthesequenceofitsmainstructuralproteingenewerealsoperformed.Inthisstudy,threeunknownvirusesnamedX-1,Y-1andZ-1wereisolatedfromthesampleswhichweremultiplicatedthroughinoculation11-day-oldmuscovyduckembryos.Intheend,theviruseswerebothdiagnosedasduckadenovirus2（DAdV-2）byPCRandtheX–1wasusedforthefollowingexperiment.Thehemagglutinationassay(HA),pathogenicityofduckembryos,cytopathiceffects(CPE)andthepHysicochemicalpropertyweredeterminedusingthesixthpassagevirus.Theresultsshowedthattheduckembryowasmaineddiedat36~72hourswithdiffusehemorrhagesymptoms.Thechickenandduckredbloodcellscouldnotagglutinatedbythepathogenandthetiterofthevirus6.31wasdeterminedas10/mLELD50.Comparedtothenormalduckembryofibroblasts(DEF),theinfectedcellswereroundandrefractiontoenhanceetc.FivepairsofspecificprimersweredesignedreferencingtogenomesequencesofKR135164.1plantinGenBank,thatwasusedtocloneandanalysisthegeneofprimarystructuralprotein(penton,hexon,fiber).Thegenomesequencesoftheproteinwereobtainedbysequencingandsplicing.DNAstar7.0andMEGA7.0analyzedthesequencesofthestrains.Theresultsshowthatthefulllengthofthehexonis2,814bpandencoding937aminoacids.ComparisonwithotheradenovirusrecordedinGenbank,thesequenceofhexongenewas100%homologyofthereferenceCH-GD-12-2014strain.ComparedtotheothertworeferenceGRstrain,thehomologyofnucleotideandaminoacidwere76.6%and86%respectively.Thelengthofthepentonis1,572bpandencoding523aminoacids.ComparisonwiththeCH-GD-12-2014strainandGR,thesimilarityforthenucleicII acidsequenceis100%homology.ComparedtotheremainingreferenceGRstrain,thehomologyofnucleotideandaminoacidwere83.7%and90%separately.Thelengthofthefiberis2,823bpandencoding939aminoacids.Thesequenceshowedthattherewas100%homologyofthereferenceCH-GD-12-2014strainatthenucleotideandaminoacidlevel.ComparedtotheremainingtworeferenceGRstrain,thehomologyofnucleotidewas45.8%.Thestudycomplementaryandenrichedthegenomeinformationofduckadenovirus2.Asolidfoundationwasestablishedforfurtherresearchaboutthegenetics,variationandthebiologicalcharacteristics.Keywords:duckadenovirus2;isolationandidentification;structuralprotein;sequenceanalysisIII 本论文常用缩略词表缩略词英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉素bpbasepair碱基对cDNAComplementaryDNA与RNA互补的DNAdDay天DEPCDietlypyrocarbonate焦碳酸二乙酸DNADeoxyribonucleotideacid脱氧核糖核酸E.BEthidiumbromide溴化乙锭E.coliescherichiacolibacterer大肠埃希氏杆菌gGram克IPTGisopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷DTMUVDuckTembusuvirus鸭坦布苏病毒hHour小时LBLysogenybroth溶菌肉汤mgMilligram毫克minMinute分钟mLMilliliter毫升NCBINationalcenterforbiotechnology国家生物技术中心pgpictogram皮克sSecond秒µgMicrogram微克µLMicroliter微升IV 目录1前言.............................................................................................................................11.1病原学......................................................................................................................11.1.1病原.......................................................................................................................11.1.2病原分类...............................................................................................................11.2Ⅰ亚群禽腺病毒的分子生物学特性.......................................................................31.2.1形态学...................................................................................................................31.2.2血凝性...................................................................................................................31.2.3抵抗力...................................................................................................................41.2.4基因组结构...........................................................................................................41.2.5病毒的复制...........................................................................................................61.2.6蛋白及其功能.......................................................................................................81.2.6.1结构蛋白............................................................................................................81.2.6.2非结构蛋白......................................................................................................101.3流行病学与致病性................................................................................................111.4Ⅰ亚群禽腺病毒诊断.............................................................................................121.4.1病理组织学诊断.................................................................................................121.4.2血清学.................................................................................................................121.4.3病毒分离鉴定.....................................................................................................121.5Ⅰ亚群禽腺病毒的防治.........................................................................................122材料与方法...............................................................................................................142.1材料........................................................................................................................142.1.1病料来源.............................................................................................................142.1.2试验动物和细胞.................................................................................................142.1.3实验仪器.............................................................................................................142.1.4主要试剂.............................................................................................................142.1.5培养基和溶液的配制.........................................................................................142.2鸭2型腺病毒地方株的分离鉴定及其生物学特性研究....................................152.2.1病毒分离与传代.................................................................................................15V 2.2.2病毒常规PCR鉴定...........................................................................................162.2.3鸭2型腺病毒巢式PCR反应检测方法的建立.............................................172.2.4第6代毒株ELD50测定....................................................................................182.2.5红细胞凝集试验（HA）...................................................................................182.2.6病毒对鸭胚成纤维细胞的致病性.....................................................................192.2.7病毒理化特性的测定........................................................................................192.2.8动物回归实验.....................................................................................................192.3鸭2型腺病毒hexon、penton、fiber基因的序列分析.....................................202.3.1X-1株hexon、peton、fiber基因引物的设计.................................................202.3.2目的片段的扩增.................................................................................................202.3.3扩增产物的胶回收.............................................................................................212.3.4连接.....................................................................................................................222.3.5氯化钙法制备感受态大肠杆菌.........................................................................222.3.6克隆载体转化DH5a感受态.............................................................................232.3.7可疑重组质粒的筛选.........................................................................................232.3.8目的基因的测序与序列结果的整理与分析.....................................................233结果与分析...............................................................................................................243.1鸭2型腺病毒地方株的分离鉴定及其生物学特性研究....................................243.1.1病毒分离结果.....................................................................................................243.1.2PCR检测结果....................................................................................................243.1.3鸭2型腺病毒巢式PCR检测方法的建立.....................................................253.1.4X-1株第6代毒ELD50测定结果.....................................................................263.1.5血凝实验结果.....................................................................................................273.1.6病毒对鸭胚成纤维细胞致病性.........................................................................273.1.7病毒理化特性的测定........................................................................................273.1.8动物回归实验结果.............................................................................................283.2鸭2型腺病毒X-1株hexon、penton、fiber基因的序列分析.........................283.2.1病毒hexon基因遗传进化分析.........................................................................283.2.2病毒penton基因遗传进化分析........................................................................29VI 3.2.3病毒fiber基因遗传进化分析...........................................................................304讨论与结论...............................................................................................................324.1鸭2型腺病毒X-1株的分离鉴定.......................................................................324.2鸭2型腺病毒X-1株生物学特性研究...............................................................324.3鸭2型腺病毒X-1株hexon、penton、fiber基因的序列分析.........................32全文总结......................................................................................................................35致谢..............................................................................................................................36参考文献......................................................................................................................38附录..............................................................................................................................42VII 1前言腺病毒（Adenovirus，AdV）是全世界家禽和野禽常见的传染性病原。1949年，从一例接种了牛结节性皮肤病病料的鸡胚中分离到第一株腺病毒，由于他嗜好感染上皮细胞而被得以命名（VandenEndeetal.,1949）。第一株从病禽中分离到的禽腺病毒由Olson从暴风呼吸道疾病的北美鹑中分离得到（Olson,1951）。随后，Huebner等在1954年进行呼吸道疾病调查过程中首次分离到人腺病毒（Huebneretal.,1954）。大多数腺病毒可在健康家禽体内复制而不产生明显的临诊症状，但在一些外在因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原，从而影响宿主的健康。然而有些腺病毒，如火鸡出血性肠炎病毒（Hemorrhagicenteritisvirus，HEV）和产蛋下降综合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)等本身就是原发病原，同时在某些特异性疾病中发现了其他一些腺病毒，说明腺病毒与一些疾病存在一定的联系。1.1病原学1.1.1病原鸭2型腺病毒（duckadenovirus2,DAdV-2）属于腺病毒科禽腺病毒属，为线状双链DNA病毒，1982年最初由JF.Bouque于法国分离得到（Bouquetetal.,1982）。2015年陈峰等（陈峰等，2015）应用宏基因组学分离鉴定出国内首株鸭2型腺病毒。1.1.2病原分类在2005年9月的第8次病毒分类报告中，腺病毒科分为哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、胸腺腺病毒属（Atadenovirus）和唾液腺病毒属（Siadenovirus）（McGeochetal.,2005）（如表1）。代表种分别为人腺病毒2型、CELO病毒、绵羊腺病毒D和蛙腺病毒。在腺病毒科中，Ⅰ亚群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属，已鉴定的5个禽腺病毒种中（其名称用字母A~E表示），每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为不同的血清型（Calneketal.,1975）。1 表1：腺病毒分类GenusSpeciesSerotypesStrainsAviadenovirusFowladenovirusAFAdV-1CELO(FAdV-A)QBVFowladenovirusBFAdV-5TR-22(FAdV-B)340FowladenovirusCFAdV-4KR-5(FAdV-C)J-2FAdV-10M-11FowladenovirusDFAdV-2SR48(FAdV-D)GAL-1FAdV-3SR49FAdV-9CFA19FAdV-11UF71FowladenovirusEFAdV-6CR119(FAdV-E)FAdV-7YR36FAdV-8aTR59FAdV-8bB3TentativeSpeciesDuckadenovirusDuckadenovirus-2(DAdV)(DAdV-2)PigeonadenovirusPiAdV-1(PiAdV)TurkeyadenovirusTadV-1(TadV)TadV-2Mastadenovirus---AtadenovirusDuckadenovirusADuckadenovirus1EDSV(AV127)(DAdV-A)(DAdV-1)SiadenovirusTurkeyadenovirusATurkeyadenovirus3PHeasantadenovirus(TAdV-A)(TAdV-3)1(PHAdV-1)2 1.2Ⅰ亚群禽腺病毒的分子生物学特性1.2.1形态学病毒粒子呈球形(如图1)，直径为70~90nm，无囊膜，呈二十面体对称结构，中间包着直径为60~65nm的髓芯，表面由252个壳粒（Capsomere）组成，壳粒排列在三角形的平面上，每边六个壳粒，由240个直径为8~9.5nm不在顶点的壳粒构成六邻体（hexon），六邻体呈棱柱状，直径7~11nm。构成二十面体的20个面和棱的大部分。12个在顶点的壳粒构成五邻体。每个五邻体与一条（哺乳动物腺病毒、胸腺腺病毒属和唾液腺病毒属）或两条（Ⅰ亚群禽腺病毒）长度为100A~370A、直径为2nm的纤突相连，纤突以五邻体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤突顶端形成头节区（knob），五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合。图1Ⅰ亚群禽腺病毒代表毒株（CELO）病毒粒子模式图1.2.2血凝性Ⅰ亚群禽腺病毒的血清型较多，在认定的12个血清型中。除了FAdV-1病毒能够凝集大鼠红细胞外，大多数Ⅰ亚群禽腺病毒不具有凝集红细胞的特性。凝集的最适温度为20～45℃，最适pH6～9之间，血凝素对RNA酶、胰酶和神经氨酸酶的处理表现稳定，但0.2%的甲醛可使血凝价降低8个滴度，56℃15min即被灭活。值得注意的是，除了大鼠红细胞，多数FAdV-1型病毒不能凝集其他动物红细胞，然而，FAdV-1(IndianaC)却能凝集绵羊的红细胞，这说明同一血清型的不同毒株在血清型内存在一些差异。目前还没有证据证明禽的其他血清型病3 毒，包括火鸡和鸭的腺病毒具有血凝作用（Bouquetetal.,1982）。1.2.3抵抗力目前为止，所有已检验过的禽腺病毒都具有典型腺病毒的特性。DNA抑制剂5-碘脱氧尿嘧啶和-溴脱氧尿嘧啶可抑制病毒的复制，由于该群病毒没有脂质囊膜，因此其对脂溶剂（如氯仿、乙醚、胰蛋白酶、脱氧胆酸钠、2%酚和5%乙醇等）具有抵抗力，同时可耐受pH3～9，但在浓度为1:1,000的甲醛中可被灭活，另外，病毒的增殖可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制。一般来说，腺病毒在水溶液中56℃30min被灭活，而存在双价离子时热稳定性会降低，但禽腺病毒却表现出较大的差异性，有些病毒株在60℃，甚至70℃30min仍具有活力，一株FAdV-1病毒于56℃180min后感染滴度迅速下降，而另一株FAdV-1在56℃存活18h，即使在同一实验所测定的毒株，其对热的稳定性也有差别，说明造成这种差异的原因并非技术问题，虽然很多学者发现二价阳离子可以降低腺病毒的稳定性，但也有学者称其并未发现此种影响，这些分歧的结果可能由于测定技术造成，因此，仔细的将悬浮病毒的介质和pH标准化很重要。1.2.4基因组结构腺病毒的基因组被包装在一个二十面体结构对称的蛋白质外壳内，为单分4子、线状、双链DNA，DNA的分子量可达3×10KDa，占整个病毒粒子的11.3%~13.5%，其余部分为蛋白。大小在26Kb~45Kb之间，根据报道（Mareketal.,2014；Ojkicetal.,2000），Ⅰ亚群禽腺病毒中CELO基因组为43.8kb，FAV-8为45kb，而DAdV-2则为43.7kb。虽然Ⅰ亚群禽腺病毒各成员之间的基因组大小存在差异，但编码结构蛋白的区域相对恒定（侯云德，1990）。不同的腺病毒的G-C含量不同，FAV-1DNA的G-C含量为54%~55%，腺病毒基因组可分为编码区和非编码区。根据DNA复制的起始时间，编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种。早期转录区有E1、E2、E3、E4四个区，编码病毒的调节蛋白。其中早一区(E1A、E1B)表达蛋白参与病毒基因和有关细胞基因的转录，是病毒基因活动的起始因子；早二区(E2A、E2B)的表达蛋白主要是调节和参与病毒DNA的复制；早三区(E3)的基因产物与病毒逃避宿主免疫系统有关，为病毒复制的非必需区，4 如果缺少部分或全部E3区，病毒仍能在组织培养细胞上繁殖；早四区(E4)的产物参与病毒DNA复制、转录子拼接、晚区基因表达和宿主细胞生物合成终止等活动。晚期转录区由Ll～L5五个区组成，主要编码病毒的结构蛋白。根据终止位点及晚期RNA转录物剪切方式的不同可分成5组，分别为：Ll（52/55k，Ⅲa）；L2（五邻体，pⅦ，pX）；L3（pVI，六邻体，内肽酶）；L4（100k，33k，PⅧ）和L5（纤维蛋白）。晚期转录区域有一个共同的三连先导序列(TPL)，主要由晚期启动子(MLP)所启动，转录产物为多顺反子，可长达20kb，通过不同的剪接加工，产生不同的mRNA，再翻译成不同的病毒蛋白（Davisonetal.,2003）。晚期区编码的结构蛋白和部分调节蛋白为装配成熟病毒粒子所必需，因此，在绝大多数人和哺乳动物及禽腺病毒中，该区域结构相对稳定。在腺病毒基因组中，各有一个40～200bp的末端倒置重复序列(invertedterminalrepeat，ITR)(如图2)分布两端，重复的次数和长度随病毒型和株的不同而异，并且与传代次数有关。每个ITR可分为AT富集区和GC富集区，AT富集区位于DNA分子的最末端，GC富集区长约50~110bp，相似性较差。对不同型和株的ITR序列比较发现，9～22位核苷酸高度保守。基因组左端载有包装信号，ITR和包装信号是腺病毒基因组复制和病毒包装必不可少的顺式作用元件。5’端有共价结合的末端蛋白(TP)，与腺病毒的感染有关，对腺病毒DNA的复制起始起着重要的作用，含有TP的DNA感染性可提高100倍。在Ⅰ亚群禽腺病毒基因组中，含有两个fiber基因。对CELO病毒纤维蛋白功能的分析表明，病毒基因组两个fiber基因长度不同，纤丝的长度与病毒的抗原性有关。经软件分析表明，fiber1基因的羧基端含有较多的亲水氨基酸，另外，抗体结合区-knob区也位于这一节点。纤突上分布有主要的种特异性抗原决定簇和次要的亚属特异性抗原决定簇，在其头部还具有血凝素等。纤突蛋白是病毒扩散重要的结构蛋白，也是病毒刺激宿主产生免疫反应的主要蛋白，具有诱导产生中和抗体的能力。fiber1对CELO病毒在体内生物学的表现至关重要，缺失fiber1后会造成病毒产量下降，导致柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackie/adenovirusreceptor，CAV)的特异性转导作用下降，使CELO病毒只能感染禽类细胞，不能感染哺乳动物类细胞（Guardado-Calvoetal.,2007）；fiber25 则对病毒增殖、组装或扩散的某个阶段是必需的，缺失fiber2不能产生病毒粒子（Guardado-Calvoetal.,2007）。图2Ⅰ亚群禽腺病毒代表毒株（CELO）基因组结构与哺乳动物腺病毒相比，Ⅰ亚群禽腺病毒最大的不同之处表现在E3区，E3区位于基因组L5区纤维蛋白和L4区的PⅧ蛋白基因之间，人腺病毒具有完整的E3区结构并与L4区有部分重叠，E3区有两个poly(A)信号，据此可分为E3A和E3B区，含9~12和ORFs，其他哺乳动物（牛、猪等）的腺病毒则具有不完整的E3区，启动子信号和人腺病毒相同，但只有一个poly(A)信号，不同动物的腺病毒的E3区长度和编码蛋白都有较大的差异，禽腺病毒没有E3区结构，在L4区PⅧ蛋白基因的终止信号至L5纤维蛋白起始信号只有197~245个核苷酸，L4与L5之间几乎相连。不可能编码有意义的蛋白质，因此，CELO和EDSV等禽类腺病毒在此区无E3区样结构，但在PⅧ蛋白基因的中下游和纤维蛋白基因起始部仍分别保留着TATABoxpolyA信号，这些保守序列可能是E3区退化变异留下的痕迹。1.2.5病毒的复制腺病毒在细胞核内复制，在很大程度上受宿主免疫系统的调控，Ⅰ亚群禽腺病毒感染细胞并进行复制的过程同一般腺病毒一样,包括以下几个阶段:（l）吸附：腺病毒进入宿主细胞是通过受体介导的胞吞作用完成的。感染细胞的过程从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始。病毒的晶状结构的纤突球部靠近易感细胞膜上的特异性跨膜受体（柯萨奇/腺病毒受体coxsackievirusandadenovirusreceptor,cAR）（Tanetal.,2001），并与其表面域结合形成高度亲和的复合物，该过程即为病毒吸附过程。CAR受体是一个糖蛋白,6 属于免疫球蛋白超家族，由两个胞外免疫球蛋白域、一个疏水a螺旋跨膜域和一个胞内区组成，是腺病毒感染易感细胞不可缺少的结构（Bewleyetal.,1999）。（2）侵入：病毒吸附到易感细胞上以后，病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合。病毒与质膜的相互作用可诱导许多信号途径。有证据表明,病毒与细胞的吸附激活了3’-OH磷酸肌醇激酶（PI-3K）途径，反过来刺激GTP酶Rho家族、肌动肮的多聚合作用和重组装，从而促进细胞吞噬作用将腺病毒内化到易感细胞。（3）脱壳：在宿主细胞蛋白酶的作用下，随着pH依赖性的胞吞囊泡的破坏，病毒粒子进入细胞质，宿主蛋白酶解离五联体降低衣壳的稳定性，六联体衣壳蛋白在细胞中可能存在的胰岛素、胰凝乳蛋白酶或papain的作用下水解成为不同大小的片段（Kiselevaetal.,1986），其他的相关蛋白也发生分离，病毒衣壳分解、释放DNA。（4）生物合成：释放出来的病毒DNA通过宿主细胞核孔进入宿主细胞核开始病毒基因组的转录。病毒基因组的早期基因转录翻译成的早期蛋白，与启动子顺式元件共同调控晚期基因的表达及DNA的复制，随之进行结构蛋白等的转录和DNA复制。腺病毒基因组进入细胞核是一个非常高效的过程,一般可以达到40%。腺病毒基因组的5'端有末端蛋白TP，它与腺病毒DNA的复制启始有关。腺病毒DNA进人宿主细胞核之后，病毒基因组开始进行立早期和早期mRNA转录，在感染后2~3h，早期mRNA即可出现在细胞质的核糖体上，并被翻译成数种早期蛋白，它们包括EZA基因编码的SSB蛋白、EZB基因编码的DNA聚合酶和DNA末端结合蛋白，这些酶和蛋白都是腺病毒DNA复制所必需的。腺病毒在感染约8h后开始DNA复制,再经历大约8h达到合成的最高峰。腺病毒复制的方式是半保留复制。DNA合成是不同步的，从线状DNA的两个5'端开始，呈单向复制，并且向两个方向延伸直到分子的另一端，两个5'端起始的效率一样，其起始引物是病毒编码的前体末端蛋白（pTP）和与之结合的dCMP，成为Ptp-dCMP复合物作为引物。但腺病毒在DNA复制时仅以一条链为模板,这样在子代DNA的合成过程中，所生成的DNA链便会逐渐置换出亲代双链中的另一条没有作为模板的链。当复制形成子代dsDNA后，被置换出的另一条亲7 代DNA单链通过末端重复序列互补产生锅柄样环形分子，并能够以此为模板进一步合成出另一条子代DNA链，并由两者互补形成dsDNA。腺病毒DNA复制除需要自身编码的TP、DNA聚合酶以及72kDaSSB蛋白外，还需宿主蛋白NF-1和拓扑异构酶Ⅰ的参与。感染后6~9h，DNA开始合成，位于16m.u.处的主要晚期启动子（MLP）启动后期基因L1~L5的转录，编码合成病毒粒子的结构蛋白。（5）装配与释放：病毒粒子的装配一般发生在感染后13~24h，病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。1.2.6蛋白及其功能病毒蛋白在病毒复制、转化和关闭宿主蛋白合成以及装配成熟的粒子等方面都起着非常重要的作用。病毒蛋白的深入研究，对确立各种蛋白在免疫发生中的作用、揭示蛋白结构与功能的关系及对病毒进行各种操作以构建基因重组疫苗、建立腺病毒载体等，都具有重要意义。腺病毒蛋白包括结构蛋白和非结构蛋白，其中病毒编码的主要结构蛋白包括六邻体（hexon）、五邻体（penton）、纤维蛋白（fiber）等。非结构蛋白包括ElA、E1B等。1.2.6.1结构蛋白(1)六邻体：六邻体蛋白是腺病毒的主要结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇（Calneketal.,1982）。对hexon蛋白电镜和X-线晶体衍射发现，hexon晶体形成一个塔形结构，两个八股反平行片层组成致密的塔底座，片层由内部的环稳定。塔区伸出到病毒粒子表面形成loop1、loop2和loop43个环。每个六邻体蛋白是hexon蛋白的同源三聚体。三聚体的hexon分子包括两个非常保守的基座区（pedestalregions）P1、P2和四个高变区（bariableloops）即loop1、loop2、loop3和loop4。其中，前段和中段主要是由loop1、loop2及P1区组成，分别位于六邻体三维结构的三角形顶端（L1、L2）和基座表面区域（P1），研究表明，FAV-1和FAV-4六邻体几个比较大的抗原表位区都位于此段，推测其具有型和群特异性抗原表位，能诱导产生特异性抗体。后段主要由Loop4、P2区组成，尽管该区域也有较好的抗原性，但疏水性氨基酸残基较多且暴露性较差，总体来讲，抗原性较弱，因此，六邻体的前段和中段可作为表达的8 首选目的蛋白。对不同血清型腺病毒hexon蛋白的序列研究表明，多数塔底区是保守的，可变区位于L1和L2。对loop1、loop2和loop4研究发现，其中loop1是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍与周围环境相互作用。loop2和loop4则卷曲成团，和三聚体中其它两个多肽链的相应区域相互作用。比较发现不同血清型FAV毒株的hexon基因的L3高变环，均编码不同的31个氨基酸，该多肽都位于该蛋白表面，是参与免疫反应的主要的抗原决定簇。Loop1、loop2所对应的氨基酸残基存在7个独特的超变区(HypervariableRegion,HVR)。在这7个HVR中，HVR1～HVR6出现在Loopl中，HVR7在loop2的塔尖。这些HVRs在不同血清型之间的长度不同，变化范围在2-38个氨基酸之间。其中HVRl、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中含有中和抗原决定簇的一部分，而且抗原决定簇至少包括两个或两个以上的HVRs。在loopl、loop2中，有些保守性残基形成HVR区的骨架，代表着临近区域不连续链的相互作用。在HVRs区中，HVRl、HVR6是内部结构，支持着塔区的loopl部分，而且HVRl是残基变化最多的区域。HVR4是loopl的主要外部支持区，HVR5位于塔尖。塔区的变化主要由这两个区域即HVR4、HVR5来决定。目前，这5个HVRs区相应的氨基酸序列以及所对应的核苷酸序列己经确定。从此研究可以看出loopl、loop2中，位于病毒表面的5个HVRs是较好的中和抗原决定簇。hexon能够刺激机体产生抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒体。P1结构域在同一群FAV较为保守，该蛋白在Ⅰ群禽腺病毒各血清型毒株间的相似性高出50％，甚至Ⅰ群的CELO与III群的EDSV相似性也高达52％，这也进一步说明I群禽腺病毒之间享有一种共同的群抗原（Lobanovetal.,2000）。hexon是禽腺病毒的主要表面抗原蛋白，含有型、型间特异性抗原表位及中和性抗原表位，但大部分抗原位点在蛋白的一级结构上尚未最后定位。一般认为，在三维结构图上，型特异性抗原位点主要定位于hexon的环区7个高变区内。型间特异性抗原表位定位于高变区之间及基部区表面的同源区域，这些表位是不同血清型禽腺病毒hexon所共有，不受腺病毒亚属的影响。型间特异性表位可以作为腺病毒的特征性标志，早在1983年就有研究表明六邻体蛋白承担着型特异性抗原决定簇，是中和抗原的靶标，也是病毒对免疫选择压力最敏感的部位。它的特异性很可能反应在氨基酸的靶序列上，作为抗原靶位用于腺病毒感染的快速诊断。9 （2）五邻体；由5个多肽相互作用而成。五邻体有类毒素活性，纯化后的五邻体在没有其它病毒蛋白存在的情况下也能引起细胞病变。五邻体基底不仅在结构上与纤维蛋白相连，在生物学功能上也与之相关。当纤维蛋白太短时，五邻体也可通过其RGD或LDV基序与细胞表面的整合蛋白作用，帮助病毒与细胞结合，有助于侵入和内化。（3）纤维蛋白；大小约62kDa，由前体蛋白水解后糖基化而来。纤维蛋白从N端至C端依次排列着与五邻体基座非共价结合的3个典型结构区域：Ⅰ（尾区）、Ⅱ（柄区）、Ⅲ（顶端球区）。纤突尾区为氨基酸保守区，与五邻体基底相连。柄区一般由22个重复亚单位构成，每个亚单位含15个氨基酸残基，但其氨基酸组成却不保守，这与腺病毒不同血清型的抗原特异性相关。顶端球区为功能区，可与相应的细胞表面受体结合，介导腺病毒与受体细胞的接触，同时血凝素也位于该区。纤维蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇。1.2.6.2非结构蛋白腺病毒非结构蛋白包括ElA、E1B、ADP(E3)、E4、pol、DBP、(E2A)、52/55K、EP、100K、33K等。E1A、ElB等蛋白的作用相对复杂。病毒的周期由E1A蛋白的表达开始，它是激活其他早期基因的启动子，具有拮抗干扰素和诱导细胞增强对肿瘤坏死因子(TNF)介导的杀伤的作用等。E1B和E4蛋白则可以阻断宿主细胞mRNA的转录和翻译。为了逃避宿主免疫系统的攻击，除E1A蛋白的抗干扰素作用外，主要由E3编码的几个蛋白实现。DNA结合蛋白和DNA聚合酶(pol)是早期基因编码、病毒DNA复制所必须的蛋白，DPB则参与决定病毒宿主范围及病毒转录和转录后水平的基因表达调控。52/55K蛋白，可参与装配过程中病毒DNA与壳粒的识别作用，它的表达先于其他L区蛋白，且可与pⅣa特异性结合，并可能参与MLP5的转录调控。100K蛋白能结合最新合成的六邻体多肽，使之发生卷曲并折叠成同源三聚体。同时，它能结合腺病毒晚期mRNA，促进含成病毒蛋白；还能使六邻体多肽从细胞内质网转运到细胞核进行装配。是腺病毒感染后期含量最丰富的蛋白。内肽酶(EP)在腺病毒中相对保守，以Cys为活性中心，与病毒粒子的成熟有一定关联。33K蛋白是空壳粒子的组成成分，参与衣壳的形成过程。10 1.3流行病学与致病性Ⅰ亚群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感，其他品种的禽类似乎不仅仅对自身的血清型易感，也对鸡血清型易感，但对此尚无充分的研究。有些病毒可致1日龄的鸡死亡，随后接种10日龄鸡却不死亡（Cook,1974）。毒力与毒株、鸡的日龄和感染滴度有关，最小致死量范围在4到300,000TCID50以上。垂直传播途径在腺病毒的传播中占有非常重要的地位，腺病毒可通过胚传播，用感染鸡的胚和子代雏鸡来制备细胞培养物时，可再激活腺病毒毒性。这是要建立无特定病因（SPF）鸡群最强的动因之一。有证据表明，在SPF鸡群中，腺病毒潜伏感染并维持至少一代而无法检测出来。虽然感染后一天就能分离到腺病毒，但正常情况下在3周后才会排毒。肉鸡排毒的高峰在第4~6周龄。后备母鸡在感染后5~9周排毒量达到高峰。从一只禽中分离到两个甚至三个血清型的病毒也不稀奇，这表明血清型之间很少有交叉保护作用。对于Ⅰ亚群禽腺病毒来说，水平传播也很重要，病毒可存在于粪便、气管和鼻粘膜以及肾脏中。因此，病毒可经各种排泄物传播，但粪便中病毒滴度最高，病毒也存在于精液中，预示着人工受精具有潜在的危险。由于Ⅰ亚群禽腺病毒作为原发病因的作用尚不清楚，所以，与其致病性有关的因素也不清楚。不同的血清型，甚至相同血清型的不同毒株，在引起发病和死亡、或者引发呼吸道疾病的能力也有所不同（Bülowetal.,1986；Dhillonetal.,1984）。在胚胎的腱移植块上生长和持续感染的能力也有差异。已发现某些病毒的基因型与毒力有相关型，但血清型与毒力之间则物相关性（Eastonetal.,1977）。尽管Ⅰ亚群禽腺病毒接种仓鼠可引起多种肿瘤，而且该病毒也可以转化人和仓鼠的细胞，但尚未证实禽腺病毒其他的血清型有致瘤性。很多研究发现，接种途径对疾病的产生极为重要，当以自然感染或直接传播的方式接种病毒式，很多分离毒都未能引起疾病，但当以非肠道途径注射感染时，这些病毒就会表现出很强的致病性。这可能意味着很多腺病毒是潜在的病原，其致病作用需要其他一些协同因子。因此，当与传染性法氏囊病病毒共感染可增强一些禽腺病毒的致病性，而与鸡传染性贫血病病毒（CIAV）共感染则可大大增强某些禽腺病毒引起肝炎和致死的能力（Bülowetal.,1986）。11 1.4Ⅰ亚群禽腺病毒诊断根据鸡群的流行病学、临床特征和剖检变化可作出初步诊断，但要确诊还需借助于病理组织学、血清学诊断和病原分离鉴定等实验室诊断方法。1.4.1病理组织学诊断病毒在细胞核内复制并产生核内包涵体，超微结构研究表明，病毒颗粒在细胞核内则以“晶状体”堆积，根据病毒蛋白和DNA含量不同，发现四种类型的包涵体，他们密度和形态各有差异。通过细胞化学或者免疫组化染色的方法，可在感染鸡组织或细胞培养物上清楚的观察到大核内包涵体，这些可用于亲腺病毒的诊断。1.4.2血清学采用双向免疫扩散（DID）试验可以检测针对群特异性抗原的抗体；间接免疫荧光试验更敏感、快速和经济；酶联免疫吸附试验（ELISA）已用来检查群特异性抗体，具有廉价和敏感的特点。也可以利用血清中和试验来检查型特异性抗体。对于任何一种血清学试验，主要问题是如何判断结果，健康和发病禽中普遍存在腺病毒种特异性抗体，但有些禽常被几种血清型病毒感染。对于致病力的预测，确定病毒基因型可能比鉴定血清型更有意义。此外，体液抗体并不能反映黏膜表面的局部免疫状态。1.4.3病毒分离鉴定分离样品可选择粪便、咽、肾、和病变组织，将样品与生理盐水制成10%悬液，反复冻融3次，离心取上清加入双抗作为接种物。虽然可用鸡的细胞，但最好还是使用被调查禽种的细胞。有许多方法可以对腺病毒分离株进行鉴定，通过电镜可直接检查培养细胞裂解物，能很快得出阳性结果。也可采用分子生物学方法进行病毒鉴定，PCR已广泛用于Ⅰ亚群禽腺病毒的检测，且可鉴定到种和血清型。1.5Ⅰ亚群禽腺病毒的防治Ⅰ亚群禽腺病毒具有较强的抵抗力，虽然有可能消灭那些具有不漏水、不透气、密封等可控制环境的房舍中的腺病毒，但是消灭商品鸡群中的腺病毒是否值得仍有疑问。因为病毒可通过种蛋垂直传播，几乎可以肯定病毒会传给下一代鸡群，所以，控制病毒只能从种鸡开始。同时，由于IBDV和CIAV都能增强Ⅰ群12 禽腺病毒的致病性，因此，在防治过程中，首先必须要控制和消灭这两种病毒。此外，从SPF鸡群获得的经验表明，水平传播也是一大问题，要保持商品鸡群不受感染相当困难。越来越多的证据表明（Xieetal.,1999），某些基因型病毒可能是原发病毒，因而免疫预防显得更有吸引力。母源抗体效价为1:64或更高可以预防IBH,但鸡出现某种程度的生长受阻。在巴基斯坦，已广泛使用用感染禽的肝脏匀浆制备的灭活疫苗，在预防心包积水综合征中获得了显著的效果（Royetal.,1999）。一项研究表明（Toroetal.,2002）：给肉用种鸡接种CIAV和FADV-4两种子代对心包积液综合征的保护力，而仅接种两种疫苗中的一种时，获得了较少的保护。这再次强调了管理控制免疫抑制性病毒感染的重要性，以便减少腺病毒的影响。研究表明（Michouetal.,1999）FADV-1(CELO)具有插入外源DNA序列的能力，因而这点具有重要意义，即将CELO作为一种疫苗载体来研发用于禽类的疫苗。将IBDV序列插入到CELO病毒的试验证明可有效表达和加工IBDV蛋白表达和加工的有效性，这表明CELO病毒可作为疫苗转载工具或者生产重组蛋白载体的可能性。13 2材料与方法2.1材料2.1.1病料来源病料采自广东惠州地区15~25日龄发生严重肝脏和脾脏出血肿胀的番鸭。2.1.2试验动物和细胞11日龄番鸭胚购自云浮市云城温氏畜牧有限公司1日龄番鸭购自云浮市云城温氏畜牧有限公司1日龄泥鸭购自云浮某无疫情的种鸭场番鸭胚成纤维细胞(MDEF)选用12～14日龄番鸭胚按常规方法制备（许静等，2012）2.1.3实验仪器电子天平：上海天平仪器厂；小型台式冷冻型高速离心机、微量移液器：Eppendorf公司产品；超净工作台：SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司；ND-1000紫外光分光光度计：NanoDrop公司；PCR仪：PTC-200；电泳仪BIO-RAD公司；琼脂糖凝胶电泳槽：北京科普仪器厂；超纯水处理器；凝胶电泳图像分析系统：英国GYNDENE公司；生化培养箱：BIOMETRA公司，立式高压蒸汽灭菌锅：Sanyo公司；微波炉：美的产品；4℃和-20℃电冰箱：海尔产品；-70℃冰箱：Thermoforma产品；FM-70制冰机：中国格兰特产品;双蒸水制备系统：MilliporeElix产品；XW-80A型旋涡混合器：上海精科实业有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海医用恒温设备厂；JC303-4A电热培养箱：上海嘉程仪器设备厂。2.1.4主要试剂MinBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0、DL2000DNAMarker、rTaq酶、PrimeSTARMax酶、pMD-19克隆载体等购自宝生物工程(大连)有限公司；LB培养基购自广州环凯生物技术公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司。2.1.5培养基和溶液的配制LB液体培养基：称取21gLB肉汤粉末，加入800mL双蒸水搅拌至其完全溶解，置于1,000mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存备用。LB固体培养基：称取21gLB营养琼脂粉末，加入800mL双蒸水搅拌至其14 完全溶解，置于1,000mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至60℃左右到入平板，冷却凝固，4℃保存备用。含氨苄青霉素（100μg/mL）LB液体培养基：在已灭菌的LB液体培养基中加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL，4℃保存备用。100mg/mLAmp的配制：称量1gAmp加入15mL离心管中，加入2mL灭菌水，混合溶解后，定容至10mL；0.22μm滤膜过除菌，分装到1mLEP管内，200μL/管，-20℃保存备用。双抗配制：取青霉素干粉一瓶（100万单位/瓶）加入2.5mL灭菌ddH2O，链霉素干粉一瓶（160万单位/瓶）加入4mL灭菌ddH2O，溶解后各取2.5mL加入5mL灭菌ddH2O，再将配置好的双抗作10倍稀释，即得到1万单位/mL的储存浓度，用时加入1%的双抗即为工作浓度100单位/mL。0.1MCaCl2：称量1.11g无水CaCl2，溶解于90mL去离子水中，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，最好现配先现用。生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠，溶于800mLddH2O中，用1L容量瓶加水定容至1L，121℃、20min高压灭菌，4℃保存备用。PBS缓冲液配制：分别称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，充分搅拌溶解于800mLddH2O中，转移至1L容量瓶加水定容至1L，然后加入浓盐酸调pH=7.4，121℃，20min高压灭菌,4℃保存备用。1%红细胞配制：采集鸭血、SPF鸡血各5mL，加入10%柠檬酸钠1mL，1,500rpm，离心5min，吸弃上清液,用生理盐水重悬，反复洗涤3次，将沉积的红细胞用生理盐水重悬配成1%红细胞悬液，4℃保存备用。电泳试剂的配制：称取1.0g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液，加热溶解,待温度降低到60℃左右时后加入5μLEB替代物，摇匀，倒胶。2.2鸭2型腺病毒地方株的分离鉴定及其生物学特性研究2.2.1病毒分离与传代将采集的可疑病料在研钵内充分研磨，按1:5~1:10比例加入生理盐水，分装到2mLEP管内，反复冻融三次后8,000rpm离心5分钟，收集上清，2.2μm过滤器过滤除菌，加入1%配制好的双抗，4℃作用过夜，病料液以0.2mL/枚，尿囊腔接15 种11日龄番鸭胚，37℃恒温培养，一天照胚2次，弃去24h内死亡的胚体，收集24～120h鸭胚，4℃过夜，回收尿囊液-20℃保存备用，连续传至第6代。2.2.2病毒常规PCR鉴定2.2.2.1病毒DNA的抽提按照TaKaRaMiniBESTviralRNA/DNAExtractionKitVer.3.0试剂盒提取病毒全基因组DNA，操作方法如下：（1）取200μL含毒鸭胚尿囊液，（2）向离心管中加入200μL的SolutionA，剧烈振荡混匀，室温静置5分钟。（3）再加入75μL的SolutionB，上下颠倒混合均匀后，12,000rpm离心5分钟。（4）将上清液液转移到新的2mlCollectionTube中，加250μL含1％冰乙酸异丙醇，上下颠倒混匀。（5）将试剂盒中的SpinColumn安置于另一新的CollectionTube上。（6）将操作4的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。（7）将500μL的RinseA(确认已加入乙醇)加入SpinColumn中，室温静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。（8）将800μL的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。（9）再次进行12,000rpm离心1分钟。（10）将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入35μLElutionBuffer，室温静置1分钟。（11）12,000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA。2.2.2.2常规PCR检测参照GenBank中登录的KR135164.1株hexon基因序列，设计1对特异的检测引物，扩增片段为633bp，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物序列如下：F1：5’-CACCTCAACAAGGAGCACAA-3’R1：5’-AGTCGGAGCTAAAGGGAATG-3’16 用DNA提取试剂盒抽提第6代鸭胚尿囊液中的DNA作为反应模板，PCR体系为:表2PCR反应体系各组分表成分加入量（μL）PreMixTaq酶10.0上引物1.0下引物1.0模板2.0ddH2O6.0总体积20.0PCR程序为：94℃5min；（94℃1min，56.6℃30s，72℃45s)×35个循环；72℃10min，4℃保存，取6uL反应产物在1%琼脂糖中电泳进行检测，与标准的DL2,000DNAMarker进行比较，观察是否扩增出与预期片段大小相符的特异性片段。取阳性产物胶回收后送英潍捷基（上海）有限公司测序，测序结果与NCBI基因库进行blast比对。2.2.3鸭2型腺病毒巢式PCR反应检测方法的建立根据上述常规PCR检测引物序列，在其序列内部利用Primer5.0软件设计合成一对特异性引物，扩增片段为483bp，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物序列如下：CH1：5’-ACAATATGACGTGGCGTTTA-3’CH2：5’-CTCGCATTTGAGACTGGTT-3’2.2.3.1巢式PCR操作步骤巢式PCR需进行两次PCR反应。第一次PCR反应方法同上2.2.2.2。巢式PCR（即第二次PCR）反应体系为20μL，其中包括PreMixTaq酶10μL，上游引物和下游引物各1μL，模板为第一次PCR产1μL，最后ddH2O补足20μL。扩增程序如下：94℃预变性5min；（94℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸30s）×35个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。PCR反应后取6uL反应产物在17 1%琼脂糖中电泳进行检测。2.2.3.2巢式PCR敏感性试验-1-2用分光光度计测量鸭2型腺病毒核酸浓度。蒸馏水10倍稀释成10、10、-3-4-5-6-7-8-910、10、10、10、10、10、10，每个稀释度取1μL为模板，分别用巢式PCR和常规PCR进行检测，1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。2.2.3.3特异性试验以鸭坦布苏病毒（DTMUV）、产蛋下降综合征病毒（EDS）、禽流感病毒（H5、H9）为模板，按巢式PCR体系及反应条件进行PCR扩增，检测巢式PCR方法的特异性，1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。2.2.3.4巢式PCR的应用用建立的巢式PCR方法检测提取的核苷酸样品。2.2.4第6代毒株ELD50测定-1-2-3-4-5-6将第6代毒株病毒原液按10倍梯度稀释成10、10、10、10、10、10、-7-810、10，每个稀释度接种8枚11日龄番鸭胚，37℃恒温培养，一天照胚2次，连续观察5天，记录死胚情况。按照Reed-Muench法计算分离株的ELD50。ELD50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数＋距离比例×稀释度间距的对数距离比例＝大于50％的阳性百分比-50%／大于50％的阳性百分比-小于50％阳性百分比2.2.5红细胞凝集试验（HA）取第6代毒株鸭胚尿囊液，用现配制的1%鸡、鸭红细胞在96孔微量血凝板上按常规方法进行红细胞凝集试验，操作如下：表3红细胞凝集试验(HA)的操作程序18 结果判定标准:100%凝集：红细胞均匀地分布于孔底周围，用“++++”表示；75%凝集：红细胞均匀地分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大小的小点，用“+++”表示；50%凝集：红细胞不均匀分布孔底周围，但孔底有一红细胞沉下的小点，用“++”表示；25%凝集：大部分红细胞沉积于孔底，用“+”表示；不凝集：红细胞完全沉积于孔底成一圆点，用“一”表示。血凝素效价以“++”为终点，即以能够使50%红细胞凝集的血凝素的最高稀释度作为该血凝素的血凝效价，一般将其称为1个血凝素单位。2.2.6病毒对鸭胚成纤维细胞的致病性将第六代病毒尿囊液接种于培养24h的鸭胚成纤维细胞（MDEF），每天观察细胞病变(CPE)情况，连续观察5天，收集细胞培养液并连续传3代，-20℃保存备用。2.2.7病毒理化特性的测定2.2.7.1病毒对温度敏感性试验将新收集的第六代病毒尿囊液分别置于4℃、37℃、56℃、70℃水浴锅中作用1h，分别测定不同温度处理条件下的ELD50。2.2.7.2乙醚与氯仿敏感试验取4mL病毒尿囊液，分别加入1mL乙醚和氯仿，同时用灭菌生理盐水作对照，4℃作用24h，将混合物3,000rpm离心5min，取下层水相，测定ELD50。2.2.7.3酸碱性敏感性试验将病毒尿囊液用0.1mol/L盐酸和NaOH调pH至3.0、5.6、7.0、9.0、10，室温作用1h，同时用灭菌生理盐水作对照，分别测定不同条件下的ELD50。2.2.8动物回归实验选取X-1株第六代毒作为种毒，0.1mL肌肉接种10羽1日龄番鸭和1日龄泥鸭，0.2mL肌肉接种10羽18日龄番鸭，1mL肌肉接种10羽产蛋前番鸭。同时各组设立5只生理盐水对照。同条件下分笼饲养，连续观察2周，记录鸭发病死亡情况，无菌采集肝脏、脾脏做PCR检测。19 2.3鸭2型腺病毒hexon、penton、fiber基因的序列分析2.3.1X-1株hexon、peton、fiber基因引物的设计参照GenBank中登录的KR135164.1株hexon、penton、fiber基因序列，设计5对特异性基因测序引物（表4），引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物序列如下：表4：引物名称及序列引物名称引物序列片段大用途primerprimersequence（5’-3’）小（bp）RemarkH1fCCACCAGTGTCATCATCTGC1903hexonH1rGAAGCCTTGTCAAGCCGTAA基因上段引物H2fCCTGAAATACAGGTCTCAGCTCCTA1345hexonH2rCTTGTGCCTCAAGTGCATCG基因下段引物PfCGAGGTTACGGATTAGCA1893penton基因引PrCGAGGTTACGGATTAGCA物F1fCGTTGTCTGTAATCCGTTTC1859fiber基因上段F1rACAGTAGGCTGAGGCTGTTA引物F2fAGTAACTGACGCCTCTATG1898fiber基因下段F2rCTGACCCGCTATACTTTT引物2.3.2目的片段的扩增上述抽提的病毒DNA作为模板，按下表PCR反应体系进行。20 表5PCR扩增体系成分加入量（μL）2×PrimeSTARMaxTaqMix25.0模板2.0上游引物1.0下游引物1.0ddH2O（RNasefree）21.0总体积50.0PCR程序为：94℃5min；（94℃30s，退火10s，72℃10s)×35个循环；72℃10min，4℃保存，再加入普通rTaq延伸10min，以添加尾巴A。退火温度和延伸时间根据片段而定，反应结束后取20uL反应产物在1%琼脂糖中电泳进行检测，取阳性结果进行胶回收。2.3.3扩增产物的胶回收按照OMEGA公司E.Z.N.AGelExtractionKit试剂盒说明书进行。1.使用TAE缓冲液缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μL进行计算。5.向胶块中加入胶块融化液BindingBuffer。6.均匀混合后56℃融化胶块，7min。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。8.将上述操作步骤6的溶液转移至SpinColumn中，10,000g离心1分钟，21 弃滤液。9.将300μL的加入SpinColumn中，室温10,000g离心1分钟，弃滤液。10.将700uL的WashBuffer加入SpinColumn中，室温10,000g，离心1分钟，弃滤液。11重复上述步骤12.将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温13,000g，离心2分钟。13.将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25μLElutionBuffer，室温静置1分钟。14.室温10,000rpm离心1分钟洗脱DNA。2.3.4连接将胶回收后的DNA连接到pMD19-T载体，混匀均匀后，16℃连接过夜。参照pMD19-T载体使用说明进行，反应体系如表6。表6连接反应各组分表成分加入量（μL）回收产物4.5pMD19-Tvector0.5SolutionⅠ5.0总体积10.02.3.5氯化钙法制备感受态大肠杆菌（1）在LB固体培养板上划线培养DH5α，37℃培养12～16h。（2）挑取单个菌落，接种到含有5mLLB培养基的试管中，37℃200～250r/min振摇过夜。（3）取过夜的菌液1mL接种到含有100mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃200～250r/min振摇培养至OD600为0.4。（4）将摇好的菌液冰浴30min，同时冰预冷的0.1mol/LCaCl2液液。（5）无菌条件下将细菌转移入灭菌50mL离心管中，4℃5,000r/min离心10min，弃去上清液。（6）每1.5mL初始培养液用0.9mL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉22 淀（轻缓吹匀），冰浴30min。（7）5,000r/min离心10min，无菌弃上清液。（8）每1.5mL加入60μL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀（轻缓吹匀）。（9）制备好的感受态细胞可冰浴过夜（不得过48h），直接用于转化、或加入无菌甘油（至浓度为15%）冻存-70℃。2.3.6克隆载体转化DH5a感受态（1）将2.3.4获得的连接产物分别加入2.3.5中所制得的100µL感受态细胞中，同时设立不加入任何DNA的simplepMD-19T载体质粒做对照。轻轻混匀后，立即冰浴30min。（2）将管放入预加温至42℃的循环水浴中，放置90s。（3）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却10min。（4）每管加800μL新鲜LB液体培养基，37℃,150rpm摇动培养45min，4,500r/min离心3min，弃上清，留下100µL重悬菌泥。（5）将上述菌泥涂布于含100μg/mLAmp的LB固体选择培养基平皿上，37℃恒温箱中平放30min，待菌液吸收完毕后，将平板倒置培养14～16h，形成单个菌落。2.3.7可疑重组质粒的筛选采用菌液PCR的方法来筛选阳性重组质粒。挑取单个菌落接种到盛有600µLLB液体培养基中，37℃200-220r/min振荡培养4h以上。以菌液为模板进行PCR，同时设阴性对照。菌液PCR反应同2.3.2。2.3.8目的基因的测序与序列结果的整理与分析将经菌液检测阳性的菌液送至广州英潍捷基公司测序，测序结果应用DNAStar7.0及MEGA7.0软件进行拼接剪切，与GenBank中注册的其它腺病毒的相应核苷酸序列进行相似性和遗传进化分析。23 3结果与分析3.1鸭2型腺病毒地方株的分离鉴定及其生物学特性研究3.1.1病毒分离结果病料研磨上清液经尿囊腔接种，能引起11日龄番鸭胚死亡，死亡时间集中在36~72h，胚体弥漫性出血明显。如图3.1.1。图3.1.1接毒后番鸭胚（左）与正常番鸭胚（右）3.1.2PCR检测结果提取不同病料病毒核苷酸，经鸭2型腺病毒特异性引物PCR扩增，1%琼脂糖电泳后，均在630bp左右处形成了特异性目的条带，产物胶回收后送英潍捷基（上海）有限公司测序，测序结果blast表明，分离到的3株毒株均为鸭2型腺病毒。分别命名为X-1，Y-1，Z-1(见图3.1.2)。但经H5、H9流感病毒、产蛋下降综合征病毒（EDS）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肝炎病毒（DHBV）特异性引物扩增均没有目的条带。24 图3.1.2常规PCR扩增结果注：M：DL2000DNAMarker；1-4分别为X-1、Y-1、Z-1和阴性对照3.1.3鸭2型腺病毒巢式PCR检测方法的建立3.1.3.1应用巢式PCR反应检测鸭2型腺病毒根据特异性引物的设计，第一次PCR反应产物大小为633bp，第二次PCR反应产物为483bp，以第一次PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，能得到单一的目的条带（如图3.1.3.1）。图3.1.3.1巢式PCR扩增结果注：M：DL2000DNAMarker；1-4分别为X-1、Y-1、Z-1和阴性对照25 3.1.3.2巢式PCR的敏感性使用紫外分光光度计测定鸭2型腺病毒阳性DNA的含量为102.1ng/uL。将DNA倍比稀释，进行巢式PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳（图3.1.3.2）。结果表明，-5-7在DNA稀释到到10时，常规PCR未能扩增到目的条带；在DNA稀释到10-5时，巢式PCR仍能扩增到目的条带，即当模板DNA浓度高于1.021×10ng/uL时，巢式PCR即能扩增出特异性条带，说明该方法的敏感性较高，比常规PCR敏感1000倍以上。图3.1.3.2巢式PCR灵敏度扩增结果0-1-2-3-4-5注：M：DL2000DNAMarker；1-10分别为DNA稀释度10、10、10、10、10、10、-6-7-810、10、10和阴性对照3.1.3.3特异性试验以鸭坦布苏病毒（DTMUV）、产蛋下降综合征病毒（EDS）、禽流感病毒（H5、H9）、新城疫（ND）、鸭肝炎病毒（DHBV）核苷酸为模板，按巢式PCR体系及反应条件进行PCR扩增，均没有目的条带，说明该方法的特异性较高。3.1.4X-1株第6代毒ELD50测定结果6.31将第6代病毒尿囊液倍比稀释，按Reed-Muench法计算ELD50为10/mL（如表7）。26 表7各稀释度鸭胚死亡情况稀释度鸭胚死亡存活累计死亡鸭累计存活鸭死亡率总数鸭胚鸭胚胚数胚数-410880170100%(17/17)-5108629281.8%(9/11)-6108353730%(3/10)-7108080150%(0/15)3.1.5血凝实验结果血凝实验结果显示凝集板中红细胞均沉积在加样孔底部，形成一个红点，分离到的病毒不能凝集鸡、鸭红细胞。3.1.6病毒对鸭胚成纤维细胞致病性第六代病毒尿囊液接种鸭胚成纤维细胞（MDEF）可致细胞变圆、聚集成团，折光性增强等病变（如图3.1.6）。A:normalB:infectedMDEFcells图3.1.6.病毒分离株感染MDEF细胞病变图3.1.7病毒理化特性的测定3.1.7.1病毒对温度敏感性试验将新收集的第六代病毒尿囊液分别置于4℃、37℃、56℃、70℃水浴锅中处用1h，接种11日龄番鸭胚，分别测定不同条件下的ELD50。27 表8不同温度条件下的ELD50测定结果温度（℃）4℃37℃56℃70℃6.196.193.18ELD50/mL10101003.1.7.2乙醚与氯仿敏感试验各取4mL细胞培养液，分别加入1mL乙醚和氯仿，4℃作用24h，同时用灭菌生理盐水作对照，将混合物3，000rpm离心5min，取下层水相，测定ELD50。表9乙醚与氯仿处理下测定ELD50结果试剂乙醚氯仿对照ELD5.185.186.3150/mL1010103.1.7.3酸碱性敏感性试验将细胞培养液用0.1mol/L盐酸和NaOH调pH至3.0、5.6、7.0、9.0、10.0，室温作用1h，同时用灭菌生理盐水作对照，分别测定不同条件下的ELD50。表10不同酸碱度条件下的ELD50结果pH3.05.67.09.010.06.196.195.182.18ELD50/mL0101010103.1.8动物回归实验结果将X-1株第6代毒0.1mL肌肉接种1日龄番鸭，部分小鸭在48h后出现了厌食、精神萎靡等症状，在接毒后4、5、6天分别有1、2、1只小鸭出现死亡，剖检小鸭采集病料并进行病原PCR检测，主要表现为肝脏、脾脏出血肿大（如图3.1.8），PCR检测能扩增出特异性目的条带。0.2mL肌肉接种18日龄番鸭，观察两周，不引起死亡，解剖无明显病变，PCR检测无目的条带。1mL肌肉接种产蛋前番鸭，无明显临床和病理变化。28 0.1mL肌肉接种1日龄泥鸭，在接毒后4、5天分别有1只小鸭出现死亡，剖检小鸭采集病料并进行病原PCR检测，主要表现为肝脏出血（如图3.1.9），PCR检测能扩增出特异性目的条带。攻毒2周后，实验组明显较对照组体重减轻。各生理盐水组正常。图3.1.8番鸭肝脏、脾脏出血肿大图3.1.9泥鸭肝脏弥漫性出血肿大29 3.2鸭2型腺病毒X-1株hexon、penton、fiber基因的序列分析使用设计的5对特异性引物经PCR扩增出目的条带，目的片段长度分别为1,903bp、1,345bp、1,893bp、1,859bp、1,898bp、琼脂糖凝胶电泳检测后获得了与预期大小相符的条带（见图3.2）。（M:DL2000DNAmarker，1~5分别为H1、H2、P、F1、F2各段序列）图3.2X-1各基因片段PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图经克隆测序获得了病毒5个片段的序列，将得到的基因组各片段经SeqMan软件去载体、拼接后，得到了病毒的hexon、penton、fiber基因全长核苷酸序列。测序结果见附表，基因全长分别为2,814bp、1,572bp和2,823bp。测序结果与GenBank中登录的腺病毒相应毒株通过DNAStar7.0及MEGA7.0软件进行序列比较分析。3.2.1病毒hexon基因遗传进化分析本研究分离的X-1株hexon基因全长2,814bp，编码937个氨基酸，序列分析表明(如图3.2.1)：与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）相似性最高，为100%，与基因库仅剩的另两株GR毒株（两者hexon基因序列相同，登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为76.6%和86%。与GoAdv-4（登录号：NC_017979.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为72.5%和82%。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因和氨基酸相似性较低。进化树结果显示，本分离株与CH-GD-12-2014株亲缘关系最近，与另两株GR毒株形成一个进化分支，与GoAdv-4聚于一大分支，和其他腺病毒，遗传进化距离较远。28 图3.2.1.1X-1分离株hexon基因遗传进化树分析图3.2.1.2X-1分离株hexon基因核苷酸序列相似性表3.2.2病毒penton基因遗传进化分析本研究分离的X-1株penton基因全长1,572bp，编码523个氨基酸，序列分析表明(如图3.2.2)：与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）和GR株（登录号：KJ469653.1）相似性最高，为100%，与基因库仅剩的另一株GR株（登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为83.7%和90%。与GoAdv-4（登录号：NC_017979.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为70.2%和75%。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因和氨基酸相似性较低。进化树结果显示，本分离株与CH-GD-12-2014株和亲缘关系最近，与另一株GR（登录号：KJ469653.1）株形成一个进化分支，与GoAdv-4聚于一大分支，和其他腺病毒，遗传进化距离较远。29 图3.2.2.1X-1分离株penton基因遗传进化树分析图3.2.2.2X-1分离株penton基因核苷酸序列相似性表3.2.3病毒fiber基因遗传进化分析本研究分离的X-1株fiber基因全长2,823bp，编码939个氨基酸，序列分析表明(如图3.2.3)：与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）相似性最高，为100%，与基因库仅剩的另两株GR株（登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为45.8%。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因和氨基酸相似性较低。进化树结果显示，本分离株与CH-GD-12-2014株亲缘关系最近，与另两株GR株形成一个进化分支，与DAdv-1和DAdv-A聚于一大分支，和其他腺病毒，遗传进化距离较远。30 图3.2.3.1X-1分离株fiber基因遗传进化树分析图3.2.3.2X-1分离株fiber基因核苷酸序列相似性表31 4讨论与结论4.1鸭2型腺病毒X-1株的分离鉴定鸭2型腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，为线状双链DNA病毒，1982年最初由JF.Bouque于法国分离得，2015年陈峰等应用宏基因组学分离鉴定出国内首株鸭2型腺病毒。本试验通过接种11日龄番鸭胚传代增殖，分离到三株未知病毒X-1、Y-1、Z-1，设计特异性引物，经测序鉴定确诊均为鸭2型腺病毒。4.2鸭2型腺病毒X-1株生物学特性研究鸭2型腺病毒属于Ⅰ亚群禽腺病毒，Ⅰ亚群禽腺病毒的血清型较多，在认定的12个血清型中。除了FAdV-1病毒能够凝集大鼠红细胞外，大多数Ⅰ群禽腺病毒不具有凝集红细胞的特性。同时，由于该群病毒没有脂质囊膜，因此其对脂溶剂（如氯仿、乙醚、胰蛋白酶、脱氧胆酸钠、2%酚和5%乙醇等）具有抵抗力。另外，酸碱度可耐受范围在pH3～9。一般来说，腺病毒在水溶液中56℃30min被灭活，而存在双价离子时热稳定性会降低，但禽腺病毒却表现出较大的差异性，有些病毒株在60℃，甚至70℃30min仍具有活力，说明该病毒对外界具有较强的抵抗力。选取X-1毒株作为研究对象，采用其第六代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变等生物学特性研究，结果表明：鸭胚主要集中在36~72小时死亡，胚6.31体全身弥漫性出血，ELD50为10/mL。不凝集鸡、鸭红细胞，在鸭胚成纤维细胞（MDEF）上可致细胞变圆，折光性增强等病变。对温度有较高耐受力，56℃1h仍保持部分毒力，对氯仿、乙醚等具有抵抗力，在20%浓度4℃处理24h仍保持较高活力。病毒对酸较为敏感，在pH为3的条件下常温处理1h失活，对碱有部分抵抗力。动物回归试验表明，1日龄番鸭和泥鸭致死率为别为40%和20%，主要表现为肝脏、脾脏肿大出血，对18日龄番鸭和产蛋前蛋鸭影响不明显。4.3鸭2型腺病毒X-1株hexon、penton、fiber基因的序列分析病毒蛋白在病毒复制、转化和关闭宿主蛋白合成以及装配成熟的粒子等方面都起着非常重要的作用。腺病毒蛋白包括结构蛋白和非结构蛋白，其中病毒编码的主要结构蛋白包括六邻体（hexon）、五邻体（penton）、和纤维蛋白（fiber）等。32 六邻体蛋白是腺病毒的主要结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇等。因此，通过对鸭2型腺病毒主要结构蛋白基因的序列分析，具有重要意义。本试验参照GenBank中登录的KR135164.1株基因组序列，设计5对特异性测序引物，对X-1株五邻体（penton）、六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）基因分段克隆测序，结果表明：分离株X-1hexon基因全长2,814bp，编码937个氨基酸；penton基因全长1,572bp，编码523个氨基酸；fiber基因全长2,823bp，编码939个氨基酸。与GenBank数据库中腺病毒序列比较发现，分离株X-1结构蛋白基因序列与CH-GD-12-2014株核苷酸、氨基酸相似性最高，均为100%，与基因库仅有的另两株GR株核苷酸、氨基酸相似性在45.8%~90%之间。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因相似性较低。本研究结果补充和丰富了鸭2型腺病毒毒株的基因组信息数据，为深入研究该病毒的遗传和变异情况奠定了基础。33 4.4展望腺病毒是家禽和野禽常见的传染性病原，大多数可在健康家禽体内复制而不产生明显的临诊症状，但在一些外在因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原，从而影响宿主的健康。鸭2型腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ亚群，相比Ⅱ、Ⅲ亚群，大多数Ⅰ亚群禽腺病毒对禽类的致病作用机理尚不清楚，不同的血清型，甚至相同血清型的不同毒株所产生的致病效果也各有不同（Bülowetal.,1986；Cook,1974；Dhillonetal.,1984）。目前报道较多的为FAdV-1~8，10型引起的鸡包涵体肝炎和FAdV-4引起的心包积液综合征（McFerranetal.,2000；常维山等，2015；李海英等，2010；王纯洁等，2003）。2015年6月以来，我国辽宁、山东、安徽等地区鸡群发生由腺病毒引起的以心包积液、肝肿大为主要特征的疾病（刘玉山等，2016；袁万哲等，2016）。该病发病区域不断扩大，给我国养鸡业造成巨大经济损失。有文献表明（Zhangetal.,2016）肌肉接种鸭2型腺病毒也能促进鸭和鸡的发病和死亡。因此，开展对鸭2型腺病毒的调查研究显得尤为必要。从1982年JF.Bouque首次分离鸭2型腺病毒以来，对该病原国内外文献报道较少，其中主要集中在全基因测序等研究内容（Mareketal.,2014；Zhangetal.,2016），关于病原检测、诊断方法及防控研究等均未涉及，针对该病原目前在国内逐步发现，围绕鸭2型腺病毒开展流行病学调查，致病机理研究以及疫苗研制等将是下一步的研究重点，以期为该病防控提供理论依据与技术支持。34 全文总结1.本研究通过接种11日龄番鸭胚传代增殖，分离到三株未知病毒X-1、Y-1、Z-1，经序列鉴定分析确诊均为鸭2型腺病毒（DAdV-2）。2.选取X-1作为研究对象，采用第六代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变等病原特性研究，结果表明：鸭胚主要集中在36~72小时死亡，胚体全身6.31弥漫性出血；ELD50为10/mL；不凝集鸡、鸭红细胞；在鸭胚成纤维细胞（MDEF）上可致细胞变圆，折光性增强等病变；对温度有较高耐受力，56℃1h仍保持部分毒力，对氯仿、乙醚等具有抵抗力，在20%浓度4℃处理24h仍保持较高活力。病毒对酸较为敏感，在pH为3的条件下常温处理1h失活，对碱有部分抵抗力。动物回归试验表明，1日龄番鸭和泥鸭致死率为40%和20%，主要表现为肝脏、脾脏肿大出血，对18日龄番鸭和产蛋前蛋鸭影响不明显。3.试验参照GenBank中登录的KR135164.1株基因组序列，设计5对特异性测序引物，对X-1株五邻体（penton）、六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）基因分段克隆测序，测序结果应用DNAStar7.0及MEGA7.0软件进行拼接剪切及相似性和遗传进化分析。结果表明：分离株hexon基因全长2,814bp，编码937个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株核苷酸、氨基酸相似性均为100%，与基因库仅有的另两株GR株（两者hexon基因序列片段相同）核苷酸、氨基酸相似性分别为76.6%和86%。分离株penton基因全长1,572bp，编码523个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）和GR株（登录号：KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性均为100%，与基因库仅剩的另一株GR株（登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸、氨基酸相似性分别为83.7%和90%。与GoAdv-4氨基酸相似性则分别为70.2%和75%。fiber基因全长2,823bp，编码939个氨基酸，与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株（登录号：KR135164.1）相似性最高为100%，与基因库仅剩的另两株GR株（登录号：NC_024486.1、KJ469653.1）核苷酸相似性均为45.8%。与其他禽腺病毒及哺乳动物腺病毒基因相似性较低。35 致谢光阴似箭，岁月如梭，三年的时间，即使在我们漫长的人生旅途中，也是显得如此的匆忙和短暂，以至于不经意间，只能回首。依稀还记得当初考研填报志愿时的场景，看到身边同学不断的降低自己的报考目标，以至于最后大部分还是选择了江农本校。平心而论，我也曾徘徊过、动摇过，但出于对华农美好的憧憬和对外面未知世界的向往，让我打消了这种种念头，破釜沉舟，置之于死地才能获得重生。付出终于换来了回报，让我有幸成为考研大军中的“幸运儿”。能选择来华农学习是幸福和快乐的，在这里，认识了更多优秀的同学和朋友，让自己无论从知识层面上还是思想层面都有了一个质的提高，华农，是我激情岁月，最美年华的见证者。在这论文即将完成之际，感触良多。古语有云“饮其流时思其源，成吾学时念吾师”。首先诚挚的感谢我的导师王林川教授，王老师简朴正直、风趣幽默，从业二十余载，扎实的理论基础和丰富的临床实践经验，为我知识的储备、各方面能力的提升都提供了极大的帮助，老师当年的“收留”，为我今天乃至今后的人生开启了一片崭新的天地。他的教诲和鞭策将激励我在以后的道路上继续努力，不断进取。在此，谨对我的恩师王林川教授致以由衷的敬意和深深的感谢。我的好挚友-崔智豪，一个热情开朗，积极乐观的广东男孩，感谢你近三年的陪伴和包容，你的热情，你的阳光，无时无刻不在影响着我，在你的“苦口婆心”、“威逼利诱”下，让我从一个沉默寡言、郁郁寡欢的“外乡人”逐渐找到了自己的位置，这其中，你为我树立了一个奋斗的目标、学习的榜样，在此，致以我最诚挚的谢意。感恩之心长存我心，感谢实验室师兄师姐三年来对我的包容和谅解，刘玲姐、张秀师姐、克山师姐、湘红师姐、丝丝师姐，牛哥，况师兄、刘金师兄、靖鹏师兄。同时还有我的同门小磊和好师弟黄路生、晓文，你们总是在我最需要的时候挺身而出，鼎力相助，谢谢你们。感谢江农小伙伴，华农同学对我学习、生活中给予的无私帮助。小鹏、凯照；庭松、耀哥，你们是最可爱的人，谢谢你们。感谢我的父母对我这么多年的支持和鼓励，回顾二十余年来经历的点点滴滴，走过的每一个脚印都浸满了你们的默默奉献，父母的爱是天下最无私，最宽36 厚的爱，你们在物质和精神上的无私付出是坚定我追求人生理想的强大后盾，大恩无以为报，唯有以永无止境之奋斗，明日辉煌之成就来报答你们今日的养育教导之恩。本实验在大华农生药研发中心完成。诚挚感谢广东大华农动物保健品股份有限公司陈瑞爱总经理、罗满林教授、唐满华副总兽医师、黄鹏华和研发中心的黄文科主任、芳姐等工作人员对本实验的大力支持，以及在日常生活中给予的无私帮助。最后，再一次向所有关心、帮助过我的家人、同学、良师益友、师兄师姐表示我最衷心的感谢和最美好的祝福。“问渠那得清如许，为有源头活水来”，离开校园并非学习的终点，“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”。37 参考文献常维山,王涛.鸡心包积液综合征(安卡拉病)病原分离检测[J].中国动物保健,2015(12):25-26.陈峰,招丽婵,覃健萍,等.应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒[J].中国预防兽医学报,2015,37(12):903-907.侯云德.分子病毒学.北京:学苑出版社，1990，151-177.李海英,尹燕博,郭妍妍,等.12株肉仔鸡包涵体肝炎病毒的分离和PCR鉴定[J].中国兽医科学,2010(07):722-727.刘玉山,史玉颖,于可响,等.鸡心包积液综合征的诊治[J].家禽科学,2016(1):31-32.王纯洁,钱丽艳,赵怀平.鸡包涵体肝炎研究进展:中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会,中国广州佛山,2003[C].许静,李进军,熊胜,等.鸭胚成纤维细胞培养、传代及保存方法的研究[J].中国家禽,2012,34(13):9-13.袁万哲,李玉保,王建昌,等.鸡心包积液-肝炎综合征的初步研究[J].中国兽医科学,2016,46(02):157-160.BewleyMC,SpringerK,ZhangYB,etal..Structuralanalysisofthemechanismofadenovirusbindingtoitshumancellularreceptor,CAR[J].Science,1999,286(5444):1579-1583.BouquetJF,MoreauY,McferranJB,etal..IsolationandcharacterisationofanadenovirusisolatedfromMuscovyducks[J].AvianPathology,1982,11(2):301-307.BouquetJF,MoreauY,McferranJB,etal..IsolationandcharacterisationofanadenovirusisolatedfromMuscovyducks[J].AvianPathology,1982,11(2):301-307.BülowVV,RudolpHR,FuchsB.FolgenderdoppelinfektionyonkukenmitadenovirusesoderreovirusunddemerregerderaviareninfektiosenAnamie(CAA)[J].JVetMed,1986,33:717-726.CalnekBW,CowenBS.Adenovirusesofchickens:serologicgroups[J].AvianDiseases,1975,19(1):91-103.CalnekBW,ShekWR,MenendezNA,etal..Serologicalcross-reactivityofavianadenovirusserotypesinanenzyme-linkedimmunosorbentassay[J].AvianDiseases,1982,26(4):897-906.38 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41 附录hexon基因序列atgctctgtccgtttagattcatccagtacgactcggccatgatgcaaaccgctctctttggacggtccctaaagaggcgccgccgggccaacagtgacactgaactagaggcggagaagcagataaaaccagagaccaccaccagcagcggtggagaccctcccattgctccaccaccgcctacacctccgccgcctcctccagctccaccgacccctactatagacctcacttatccctactggtggccctctccaaactaccctggaggtggagggggtgggggtggtagctgcacgtgtcagggagacccactgggacccatcgtcaagacaaatacaggttttaacatcagactgcaagcccctgtggtgttgtcaggctcaaaagctgtgacactagcagtagacaacactcttcagactgatgggcagtcagttggggttaagctgtcttcacccatgattagtacgagtagtggtgtcacactcgacacaggagacggacttacatttgacagcggacggctgaacgtggcctgcacaccacgcagaagccttaaagtgactagcaccggtctagacatagtcacagatgtaacgataaacaactctgacacactgggtgtcaacatcaaaacaaacggaggacttaagttcgactcagccggaataagagttgcagtcgatggaacgacagtaaaagtcaattcaaacggtgttctacaggcactgccccaagtttctaatgctgtaaatgcaatggaaattggatcaccagaatcagacagcggaaaagtgtacgcagccactgaagacaataaaatagtggtaacacgaccgtacatatacatggtttccgcagcaggattggtgaacggtgtcatcaacgtcaaaatacctaaaaatctacagcttgacaagaacccctacactccaagtggacactttaagttcactataatcgtaccgttcgacaaacaatttaatgttgctaatttacccccgtatgtcactatacctgacacagtggaagtaagtagcttcgcaccgaacaagctattagacctcggtggattcacaggggttccatacatttctacagatttggaagatgagacaacaaattggtatgtcaaccaggacagtgaaggattctccaaaataaaatttttccccgcgactagtggagtcacagtaactgacgcctctatggcgtacgggatagtattgtgtactaaaacaggagcatcgtatgcatcagatgctcttgctttttcgtttgacatcacaatgacgtctacttgggctgacgtaccaacgcaagcatccatgactaccggtcctttgtttttctcgtacctagcgaagattgtataaatgaaacggaccaacagatcagacaatggtgaaggattcacaaagcgtgcgaagattcaggcatctgcttctgcgacaatcgacctaacatatccgttctgggagcaagcttcgagtgccaacccgataaatcctccgtttgtcaccggaccactgtatgatgacaacgggtatcttaacgtaagaacatccgacccgataagaaccgttggtaacagcctcagcctactgtacgatgattcgctagctgtgacaagtggcaaactaggcgttaaaatcgacccaaacgggcctctagatgagtcgcccgctggactcagtttagctctaggagacggtcttgaagaagacgagttcacaggtttatctgtaaaaccagatccacgtggccctatcgaagtgtcagatgaaggagtgggtatagcctatgatacagaaaccatgtcaataacatcaatgcaaccaaattcacagatgactctcggtgtacgactaaaccccgatggtgcactacacagtaacaacggattagatgtaaaaattgatgatgatgcgttgatagtcagcgacgaaggcctaacagtactcgttagtgaaagcgggccacttacaatcgaccctggcaaaggactggatattgatatcgatcaatcactctccgttagaactaatcctcaaggagagaaagagttaggcatcaacatcatccccacatcgtgcataacactagacaacggaggcctcgacctcaaggtggacccaggaagcctggccgtcactgacaataccctacacctcacaagctcatactcaacctatgtctttacgagtggatctgacacacttcagaagacacaagcccaagtgtgctgcggagcagggtctgttacgtttccgtgcgcatactatgccaagatcgtatgctcaaacaatgtgtcttcaggatatataacactgaaggtgagcgctgaggatgcatcacatgctgtagatcaacgcttcgcgactattcaaccagtattcacattctggttatgtcgagacataggtaatgaaaacaccgtcaatttttcccactgtaccaacaacagttataagccagaggaaaccgcagtcgttaaggcatgcatcacaccagcatacaaaaattttg42 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