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《犬2型腺病毒六邻体蛋白结构分析、改造及其基因转移载体的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、犬2型腺病毒六邻体蛋白结构分析、改造及其基因转移载体的研究【中文】重组腺病毒基因转移载体被广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究领域。目前,动物腺病毒常被应用于相应易感动物重要疫病的重组疫苗研究,并已显示出良好的安全性。本实验室在前期工作中,建立了以犬2型腺病毒(CAV-2)为载体表达狂犬病病毒弱毒株SRV9糖蛋白的重组CAV-2疫苗,免疫试验结果表明,该重组疫苗可诱导动物机体产生针对狂犬病病毒的具有保护水平的中和抗体。该重组腺病毒是针对复制非必须区E3区进行缺失并插入外源基因,外源基因只能以分泌形式进行表达,与完整的病毒颗粒相比,外源蛋
2、白诱导的抗体水平较低,虽然已达到国际要求的保护水平,但仍有进一步提高的空间和必要。重组病毒免疫中和抗体水平较低的原因是多方面的,在很大程度上与外源蛋白产量不高以及相当数量的靶动物机体本身携带的抗腺病毒抗体相关。因此,本研究进行了以犬2型腺病毒主要衣壳蛋白——六邻体为基础表达外源性抗原表位的基因转移载体的探索性研究。腺病毒衣壳由三个主要衣壳蛋白构成:六邻体、纤突和五邻体基质。六邻体,是结构最大、数量最多的腺病毒衣壳蛋白,构成整个病毒粒子的衣壳表面。在成熟病毒粒子中,六邻体是以单体三聚化形成病毒的二十面体结构,因此每个病毒粒子共含有72
3、0个拷贝。人的2型和5型腺病毒晶体结构已经得到实验解析,每个六邻体单体的基底部由两个β折叠基序构成,从基底延伸出三个长环形成了分子顶端的“塔” 犬2型腺病毒六邻体蛋白结构分析、改造及其基因转移载体的研究【中文】重组腺病毒基因转移载体被广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究领域。目前,动物腺病毒常被应用于相应易感动物重要疫病的重组疫苗研究,并已显示出良好的安全性。本实验室在前期工作中,建立了以犬2型腺病毒(CAV-2)为载体表达狂犬病病毒弱毒株SRV9糖蛋白的重组CAV-2疫苗,免疫试验结果表明,该重组疫苗可诱导动物机体产生针对狂犬病病毒
4、的具有保护水平的中和抗体。该重组腺病毒是针对复制非必须区E3区进行缺失并插入外源基因,外源基因只能以分泌形式进行表达,与完整的病毒颗粒相比,外源蛋白诱导的抗体水平较低,虽然已达到国际要求的保护水平,但仍有进一步提高的空间和必要。重组病毒免疫中和抗体水平较低的原因是多方面的,在很大程度上与外源蛋白产量不高以及相当数量的靶动物机体本身携带的抗腺病毒抗体相关。因此,本研究进行了以犬2型腺病毒主要衣壳蛋白——六邻体为基础表达外源性抗原表位的基因转移载体的探索性研究。腺病毒衣壳由三个主要衣壳蛋白构成:六邻体、纤突和五邻体基质。六邻体,是结构最
5、大、数量最多的腺病毒衣壳蛋白,构成整个病毒粒子的衣壳表面。在成熟病毒粒子中,六邻体是以单体三聚化形成病毒的二十面体结构,因此每个病毒粒子共含有720个拷贝。人的2型和5型腺病毒晶体结构已经得到实验解析,每个六邻体单体的基底部由两个β折叠基序构成,从基底延伸出三个长环形成了分子顶端的“塔”区,形成病毒粒子的外部。比较不同血清型腺病毒六邻体蛋白发现,凸出于衣壳表面的环相对应的序列在氨基酸顺序和长度上都缺乏保守性,这些非保守区序列被称为超变区。基于人腺病毒不同血清型六邻体序列比对的早期研究,认为在六邻体蛋白分子中存在七个超变区,最近文献中
6、报道了更精确的人2型腺病毒超变区的位置,并且发现第7超变区是由三个独立的非保守区构成,因此超变区数目最终确认为九个。研究表明超变区不参与维持六邻体结构的完整性,因此假设对其氨基酸残基进行修饰改造不会影响病毒的包装。近来已有许多关于人腺病毒六邻体超变区改造成功的报道,分别是在不同超变区插入或替换为不同长度的外源序列肽段,突变后显示重组病毒的形成、稳定性和天然受体介导的病毒感染等生物学特性同原始病毒相近,并且能够检测到外源基因以不同程度和形式的表达。为了探索以犬2型腺病毒六邻体蛋白为基础基因转移载体研究的可行性,建立一种犬腺病毒抗原表位
7、展示技术,本研究通过生物信息学手段分析CAV-2六邻体蛋白结构,推断超变区的位置,然后在不同超变区替换入狂犬病病毒糖蛋白线性表位,通过重组病毒的包装探索CAV-2六邻体蛋白中可修饰的区域,验证超变区的位置,从而为构建一种新型的基因转移载体,并作为抗原展示性疫苗研究奠定基础。本实验首先通过PCR分别获得犬2型腺病毒疫苗株YCA-18和弱毒株CC0710六邻体蛋白基因,进行克隆及测序,并推导氨基酸序列,与其它已知不同血清型的哺乳动物腺病毒六邻体蛋白序列进行比对,利用蛋白质同源模建方法预测CAV-2六邻体蛋白的二级、三级结构,与已经实验方
8、法解析的人2型和5型腺病毒六邻体蛋白结构进行比较分析,推导出CAV-2六邻体蛋白超变区的可能位置。根据不同超变区在六邻体蛋白中所处的空间位置,选择位于蛋白表面的第2、3、5和7超变区作为改造靶点。在本实验室前期构建的CAV-2感染性全
