蜜蜂残翼病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

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1、分类号：S895.9单位代码：10193密级：公开学号：2012642硕士学位论文蜜蜂残翼病毒的分离鉴定及全基因组序列分析IsolationandGenomicSequenceAnalysisofDeformedWingVirus作者姓名：郑言学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：畜产品检验与食品安全指导教师：王振国研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中

2、不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留

3、送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要蜜蜂残翼病病毒（Deformedwingvirus,DWV）是引起蜜蜂残

4、翼病的病原体，可侵染各发育阶段的蜜蜂，在蛹期危害不明显，但羽化后出现翅膀残缺并迅速死亡；成年蜜蜂发病后翅膀畸形、腹部萎缩和褪色。呈隐性感染的蜜蜂虽然无明显临床症状但其寿命也会缩短。由于DWV与传播媒介瓦螨密切相关而被大量研究。近年来的研究表明DWV是引发“蜂群崩溃失调症”（Colonycollapsedisorder,CCD）的主要病毒之一，DWV在全球范围的流行已成为蜜蜂蜂群非正常消失的一个重要原因。DWV属于传染性软化病毒科（Iflaviridae）、传染性软腐病病毒属（Iflavirus），为单股、正

5、链RNA病毒，基因组为单顺反子，病毒直径约为30nm，形状为二十面体。本研究对获得到的疑似DWV病料处理后，在健康的蜜蜂幼虫体内进行分离培养，由于DWV隐形传播的特性，在分离培养过程中未发现翅膀畸形等典型症状，但通过透射电子显微镜观察，发现了DWV的病毒粒子。根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病（DWV）的基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）,在其保守区设计一对特异性的扩增引物，利用RT-PCR检测方法鉴定后，初步判断获得到了一株DWV。对获得到的基因进行克隆测序后，通过Ge

6、nBank上的Blast程序进行比对，发现与GenBank上公布的美国株蜜蜂残翼病毒序列高度同源，同源性为96%。进一步证明了本研究成功分离到了一株蜜蜂残翼病毒。本研究根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病（DWV）的基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）,采用TaqMan荧光标记探针技术原理，针对蜜蜂残翼病毒的保守序列，设计出一对特异性引物和一条探针，建立了一种快速检测蜜蜂残翼病毒的荧光PCR方法。该方法能够特异性的检测蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒和黑蜂

7、王台病毒且无交叉反应，同时本方法能够检测1.0×102拷贝/µL的阳性质粒，对低病毒含量的样品检测灵敏度较高，且本方法的重复性和稳定性较好，变异系数小于1.6%。该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点，适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂残翼病毒的快速检疫。为了对蜜蜂残翼病毒的分子结构及分子生物学特性更深入的了解，我们对该病毒进行了基因组序列测定。根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病毒基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）设计出11对扩增引物，利用引物步移方法策略，以病料中提取的病毒总

8、RNA为模板，扩增得到了11段覆盖基因组的互相重叠片段，经过克隆、测序及软件拼接，最终得到基因组序列。测序结果表明，所测的蜜蜂残翼病毒基因组有9826个核苷酸序列组成，编码2375个氨基酸。通过相关分子生物学软件对所测序列进行分析，分析发现其I与GenBank公布的USA1（AY292384）有很高的同源性，达到96.6%。通过系统进化树比较分析发现该病毒与Korea1（JX878304）和Korea2（JX87