广西马源h9n2亚型流感病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

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1、广西大学硕士学位论文广西马源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定与全基因组序列分析姓名：何奇松申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刘棋20120630广西马源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定与全基因组序列分析摘要本研究采用RT-PCR和血清学相结合的方法对从广西4个市采集的马肺组织样品和马血清进行H9N2亚型流感病毒的检测，从284份马肺组织样品接种鸡胚后收取的尿囊液中，检测出1份阳性，阳性率为O．35％；而检测的1110份马血清，H9N2亚型阳性有7份，阳性率为0．54％。应用鸡胚接种的方法分离出一株病毒，通过血凝抑制实验及对

2、8个片段的全基因克隆及序列分析，鉴定为H9N2亚型流感病毒，将分离株命名为A／equine／Guangxi／3／201l(H9N2)(简称GX3株)。对GX3株进行鸡胚半数致死量(ELD50)和1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)测定试验，其ELD50和ICPI值分别为10。6’43／0．2mL和O．09；经免疫效果试验证明GX3株具有较好的免疫原性；对GX3株各基因的关键位点分析发现，GX3株HA基因的氨基酸在第183、225、227及228位点处均非常保守，而在226位氨基酸为亮氨酸(Leu)，具有受体SAa一2，6-Gal特

3、异性；在HA裂解位点处含有2个碱性氨基酸，其HAl与HA2氨基酸裂解位点处的序列为RSSRGLF，具有典型的低致病性流感病毒裂解位点的氨基酸序列特征；PB2基因第627、701、714位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)，PBl．F2蛋白的第66位氨基酸为天冬酰胺(Asn)，NP基因第319位氨基酸为天冬酰胺(Asn)，NSl蛋白的第92位氨基酸为天冬氨酸(Asp)，这些都说明GX3株为低致病性毒株。糖基化位点分析中，HA和NA基因均具有8个糖基化位点，其中HA在第313位氨基酸处比参考毒株多出一

4、个糖基化位点，NA在第44位氨基酸位点处比参考毒株多出一个糖基化位点，而其余的糖基化位点均比较保守，没有出现明显改变。耐药性基因位点分析中，NA基因119E、151D、276E、292R、294N，表明GX3株对神经氨酸酶抑制类药物敏感；M2基因S31N，表明GX3株具有金刚烷胺类药物的抗性。通过系统进化树及核苷酸同源性分析可知GX3株各个基因片段的大体来源：PB2和M基因来源于G1．1ike亚系毒株，PBl、PA和NP基因来源于SH／F／98一like亚系毒株，NA基因来源于G9．1ike亚系毒株，HA和NS基因来源于BeiJ

5、ing亚系毒株。可见，本研究的GX3毒株的基因片段来源于4个经典的H9N2毒株，组合成了一个新的基因型。关键词：流感病毒；H9N2亚型；分离鉴定；全基因克隆；序列分析ISOLATIONANDWHOLEGENOMESEQUENCEANALYSISOFEQUINEH9N2INFLUENZAVIRUSINGI7ANGⅪABSTRACTUsingRT-PCRandserology,H9N2subtypeinfluenzaviruswastestedinsamplesofhorsetissueandserumcollectedfromfo

6、urcitiesinGuangxi．Theresultsshowedthatamongthe284tissuesamplesinoculatedfromchickembryo，onewaspositivewiⅡlthepositiverateofO．35％and7werepositivewiththepositiverateofO．54％amongstthe10serums．AnisolateofviruswasidentifiedasH9N2subtypeinfluenzavirusbyhemagglutination，hem

7、agglutination—inhibiton，andnamedA／equine／Guangxi／3／2011(H9N2)(abbreviatedtoGX3virus)．CompletegenomeWassequencedandanalyzed．Thepathogenicityoftheviruswasdetermined．TheELD50andICPIvaluewere10．6．43／0．2mLandO．09，respectively．Animalexperimentdemonstratedt

8、latGX3viruswasal

9、owpathogenicinfluenzavirusandpossessedgoodimmunogenicity．AnalysisofkeysitesinGX3virusindicatedthataminoacidsin183，225，227and228site