2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调及体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究

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分类号：R683.4UDC：密级：重庆医科大学博士学位论文2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调及体外高糖论文题目干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究作者姓名孙明启指导教师姓名（职称、单位名称）蒋电明教授重庆医科大学附属第一医院骨科申请学位级别博士学科、专业名称外科学论文答辩年月2016年5月2016年5月 目录英汉缩略语名词对照..................................................1中文摘要............................................................2英文摘要...........................................................11论文正文2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调及体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究....................................25前言..........................................................25第一部分2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调机制的相关研究........311材料和方法...................................................322结果：.......................................................403讨论.........................................................494小结.........................................................50参考文献.......................................................50第二部分体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究......541材料.........................................................552结果.........................................................613讨论.........................................................694小结.........................................................70参考文献.......................................................71综述一............................................................75综述二............................................................83致谢.............................................................88攻读博士期间发表的论文及参加申报的课题.............................89 重庆医科大学博士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称TNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子FBSFetalBovineSerum胎牛血清PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液lMicroliter微升mlMilliliter毫升rpmRotatespeedpermin每分钟转速UUnit单位T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病DMEMDulbecco’smodifiedEagle’smedium杜尔伯克改良基础培养基ODOpticaldensity光密度hsCRPC-reactiveproteinC-反应蛋白IP-10IFN-γ-inducibleprotein10干扰素诱导蛋白10NF-κBNuclearfactorkapaB核因子kapaBIL-1βInterleukin白细胞介素1βMMP-9Matrixmetalloproteinases-9金属基质蛋白-9NEAANonEssentialAminoAcids非必要氨基酸ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验BSABovineSerumAlbumin小牛血清SDS-PAGSodiumdodecylsulfatepolyacrylamide十二烷基硫酸钠聚丙烯酰gelelectrophoresis胺凝胶电泳PARPPoly(ADP-ribose)polymerase聚腺苷二磷酸-核糖1 重庆医科大学博士研究生学位论文聚合酶2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调及体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究摘要第一部分2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调机制的相关研究目的：检测2型糖尿病患者骨折后静脉血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量，并与非糖尿病骨折患者和糖尿病非骨折患者比较，为研究2型糖尿病患者炎症因子及趋化因子在骨折愈合过程中的作用垫定基础。方法：自2014年9月-2015年10月在内蒙古医科大学第二附属医院骨科就诊的患者中，随机选取28例2型糖尿病骨折患者（其中6例胫骨骨折，11例胫腓骨骨折，11例股骨骨折），同时选取25例非2型糖尿病骨折患者（其中4例胫骨骨折，12例胫腓骨骨折，9例股骨骨折）作为对照组1；另外选取22例糖尿病非骨折患者；全部患者在进行研究前均签署患者知情同意书，全部实验过程通过内蒙古医科大学第二附属医院伦理委员会伦理审核。三组患者均在接诊后立刻抽取静脉血标本。全血标本离心分离血清，按照说明书操作步骤利用酶联免疫吸附2 重庆医科大学博士研究生学位论文试验定量测量hsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES，其主要操作有，孵育酶标板，分别加入三组的血清，并依次加入封闭液，牛血清，标准血清，分别加入hsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES辣根过氧化物酶的多克隆抗体，最后在450nm波长下，用分光光度计测量其OD值。人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham'sF12的基质和Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养液中培养，培养液中添加2.5mM左旋谷酰胺和0.3mg/mlG418，并且添加10%小牛血清hFOB1.19，细胞在5%CO2，37°C环境下温箱中培养。其中高糖环境造模方法为，将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α，以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。依据产品说明书，用TRIzolreagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂盒提取人类成骨细胞MG-63的mRNA，最后添加1μlRNasin®PlusRNaseInhibitor的终止液，用TakaraOneStepRT-PCTkit检测TNF-α和IL-1βmRNA的含量，TNF-α(PF:5'-TCTCATCAGTTCTATGGCCC-3',PF:5'-GGGATGAGACAAGGTACAAC-3'),IL-1β(PF:5'-AAGCTGAGGAAGATGCTG-3',PR:5'-ATCTACACTCTCCAGCTG-3')和β-actin(PF:5'-TGTACGCCTCTGGCCGTACC-3',PR:5'-GATGGGCACAGTGTGGGTGA-3')，每个反应循环中反应20µL溶液中包含4µL5xRT-PCRBuffer,1µLdNTPMix，2µLRNA,0.5µLforward/reverseprimer(10µM),0.5µLRNaseinhibitor,反转录过程中，42°C孵育5分钟，95°C反应10秒，后95°C，5秒后60°C203 重庆医科大学博士研究生学位论文秒重复40个循环，∆∆Ct法定量测量TNF-α和IL-1β比β-actin的相对量。参照细胞浆的蛋白用和细胞裂解液(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白，并辅以蛋白酶抑制剂（罗氏生化试剂盒，巴塞尔，瑞士）。待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点被3%的小牛血清进行封闭、阻断并在4°C过夜，然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体和a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时，然后接种用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在室温下封闭1小时。最后，用化学免疫发光（ECL）检测系统检测其特异性结合。TNF-α和IL-1β水平用其与GAPDH相对灰度值表示。结果：1、2型糖尿病骨折患者前炎症细胞因子的上调为了研究2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律，本研究测量了2型糖尿病骨折、非骨折和骨折非糖尿病患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES含量的变化，并进行组间比较，实验前患者的基线资料在性别、年龄体重指数、患病时间和空腹血糖水平均进行比较，三组间各项指标间差异均无统计学意义。血清hsCRP的水平，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，同样，促炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的水平也是2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，组间比较差异均有统计学意义，IP-10和RANTES的水平与以上因子规律4 重庆医科大学博士研究生学位论文相同，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，差异具有统计学意义，由以上结果说明，高糖可以促进骨折患者炎症相关因子升高。2.高糖诱导成骨细胞MG-63产生肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β规律的研究为了进一步研究2型糖尿病患者促进前炎症因子和趋化因子分泌增多的机制，我们进一步在mRNA和蛋白水平研究了高糖诱导成骨细胞TNF-α和IL-1β的水平变化，我们分别用5,10,20和40mM的葡萄糖与成骨细胞MG-63共培养12小时，利用RT-qPCR和ELISA的方法测量其相关指标。我们发现TNF-α的mRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，为（2.823±0.2751），其次为20mM葡萄糖组为（1.680±0.1589），不同浓度组间比较，差异具有统计学意义，且TNF-α的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性；IL-1βmRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高为（4.574±0.4457），其次为20mM葡萄糖组为（2.847±0.1775），不同浓度组间比较，差异具有统计学意义。TNF-α的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性，以上两类因子在蛋白水平的表达规律与在mRNA水平一致，不同浓度组间比较差异均具有统计学意义。结论：1.2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律为2型糖尿病骨折患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含5 重庆医科大学博士研究生学位论文量大于2型糖尿病非骨折患者，前两者大于骨折非糖尿病患者。2.TNF-α和IL-1β在mRNA水平和蛋白水平随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，其次为20mM葡萄糖组，不同浓度组间比较，差异具有统计学意义。TNF-α和IL-1β的mRNA的含量和蛋白水平与葡萄糖的浓度呈计量依赖性。关键词：2型糖尿病；成骨细胞；骨折；炎症趋化因子；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素1β；mRNA6 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究目的：检测在不同浓度葡萄糖干扰下肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞MG-63凋亡的规律，并通过基因敲除的方法将成骨细胞TNF-α片段敲除，检测对成骨细胞凋亡和凋亡相关因子表达的影响，为研究2型糖尿病患者TNF-α在骨折愈合过程中的作用分子机制及防治骨折不愈合垫定基础。方法：将人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham'sF12的基质和Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养液中培养，培养液中添加2.5mM左旋谷酰胺和0.3mg/mlG418(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)，并且添加10%小牛血清hFOB1.19，细胞在5%CO2，37°C环境下温箱中培养。高糖环境造模方法，将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α，以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。用MTT法检测人类成骨细胞MG-63细胞活力，以下简单描述MTT法，将85%细胞浓度的人类成骨细胞MG-63均匀种植在96孔板上，分组并用5,10,20or40mMD-glucose,和5,10,20or40ng/mLTNF-α共培养24,48和72小时，然后在每个孔中加入10μLMTT试剂，37°C下孵育4小时，再每个孔加入100μLDMSO后，在波长570nm7 重庆医科大学博士研究生学位论文下，用ELISAplate仪测量各组的吸光度。用annexinV-FITCapoptosisdetection试剂盒检测MG-63细胞的凋亡，1×106的MG-63细胞，用annexinV-FITCandpropidiumiodide试剂盒进行染色，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平，其结果用凋亡细胞比全部细胞的比值表示。参照细胞裂解液(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白，并辅以一蛋白酶抑制剂（罗氏生化试剂盒，巴塞尔，瑞士）。待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点被3%的小牛血清进行封闭，阻断并在4°C过夜，然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体或a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时，然后接种用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在室温下封闭1小时。最后，用化学免疫发光（ECL）检测系统检测特异性结合。细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白水平用其与GAPDH相对灰度值表示。结果：1.肿瘤坏死因子-α和葡萄糖降低成骨细胞MG-63活力机制本部分我们设想肿瘤坏死因子-α和葡萄糖能够诱导降低成骨细胞MG-6活力，因此我们通过MTT实验检测在不同浓度的肿瘤坏死因子-α和葡萄糖干扰下，细胞活力的变化，我们发现，用40mM的葡萄糖培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，同样，在20和40ng/mL的肿瘤坏死因子-α培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，不同浓度组间差异具有统计学意义。当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞8 重庆医科大学博士研究生学位论文时，10ng/mL肿瘤坏死因子-α可以显著性降低成骨细胞MG-6活力；当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞时，20和40ng/mL肿瘤坏死因子-α成骨细胞MG-6的活力水平比0和10ng/m低，组间比较差异具有统计学意义，细胞活力与肿瘤坏死因子-α呈计量依赖性；为了进一步研究葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对成骨细胞活力影响的交互作用，我们将5mMD-glucose培养组设置为对照组，单纯20mMD-glucose培养组,单纯20ng/mLTNF-α培养组和既有20mMD-glucose又有20ng/mLTNF-α混合组间成骨细胞活力进行比较，我们发现，单纯20mMD-glucose组和单纯20ng/mLTNF-α组间成骨细胞活力变化差异无统计学意义，同时有20mMD-glucose和20ng/mLTNF-α干扰组成骨细胞活力在细胞培养48和72后显著性下降，差异与其他组间具有统计学意义2.肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导成骨细胞MG-63凋亡及相关凋亡蛋白的研究为了进一步研究肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导的成骨细胞凋亡机制，我们将实验分为三组，分别为单纯肿瘤坏死因子-α组，单纯葡萄糖组和肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组，单纯葡萄糖组中，20mMD-glucos与5mMD-glucose诱导成骨细胞凋亡差异无统计学意义，然而在20mMD-glucos中再加入20ng/mLTNF-α并培养24小时和48小时后，会使成骨细胞凋亡显著性上调，差异具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率均大于与其他组，其组间差异均具有统计学意义；同时我们又利用免疫印迹的方法检测9 重庆医科大学博士研究生学位论文了各组间细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量的变化，单纯20mM葡萄糖培养成骨细胞不会影响其凋亡蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量的变化，如果将20mM葡萄糖再加入20ng/mLTNF-α培养成骨细胞，可以显著性的促进成骨细胞分泌细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白，组间比较差异具有统计学意义。结论：1.葡萄糖和肿瘤坏死因子-α与成骨细胞MG-6的活力呈计量依赖性。2.D-glucose与TNF-α共同干扰成骨细胞48和72后，活力显著性下降。3.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率显著大于与单纯干扰组。4.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量显著大于与单纯干扰组。关键词：2型糖尿病；成骨细胞；骨折；肿瘤坏死因子-α；凋亡相关蛋白；细胞活力；凋亡10 重庆医科大学博士研究生学位论文TNF-αisupregulatedinT2DMpatientswithfractureandpromotestheapoptosisofosteoblastcellsinvitrointhepresenceofhighglucoseABSTRACTSection1ThestudyofTNF-αisupregulatedinT2DMpatientswithfractureObjective:Fracturedetectioninpatientswithtype2diabetesaftervenousserumhs-CRP,TNFalpha,beta,IL-1IL-6,IP-10andthecontentofRANTESandthefractureandfracturepatientswithoutdiabetesanddiabetespatientswerecomparedwitha,forthestudyofinflammatorymarkersinpatientswithtype2diabetesandchemokines,layafoundationroleinthefracturehealingprocess.Methods:1.SerumsamplesfrombonefracturepatientswithorwithoutT2DMTotalof28T2DMpatientswithbonefracture(6casesoftibialfracture,11casesoffractureoftibiaandfibulaand11caseoffemoralfracture)wereimplicatedinthisstudy.Andtherewere25casesofbonefracturepatients(4casesoftibialfracture,12casesoffractureoftibiaandfibulaand9caseoffemoralfracture)withoutT2DMorT1DMweretakenascontrol.Inanother11 重庆医科大学博士研究生学位论文controlgroup,therewere22T2DMpatientswithoutbonefractureandinfectiousdiseases.Allserumsampleswereisolatedfromthefirstvenousbloodspecimensfromsubjectswithbonefracturewhenregisteredatemergencydepartment.DetailedcharacteristicsofthesesubjectsweredescribedinTable1.Writtenconsentwasobtainedfromeachsubjectbeforethestudy.AndthestudywasapprovedbytheEthicsCommitteeoftheAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity.2.CellsmediumandreagentsHumanMG-63osteoblast-likecellswereprovidedbythecellresourcecenterofChineseacademyofmedicalsciences(Beijing,China)andwereculturedinEagle'sminimalessentialmedium(EMEM)(GIBCO,Rockville,MD,USA),supplementedwith2mMGlutamine(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO,USA),1%NonEssentialAminoAcids(NEAA)(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)and10%fetalbovineserum(FBS)(Gibco,Rockville,MD,USA).Thecellswereincubatedat37°C,with5%CO2.D-glucoseandTNF-αwerepurchasedfromSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)andweredissolvedinEMEMwith2%FBS.3.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)forcytokinesSerumorsupernatantlevelsofhsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10andRANTESwerequantitativelyexaminedwiththesolidphaseenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kit(Abcam,Cambridge,UK)underthe12 重庆医科大学博士研究生学位论文guidanceofproduct’smanual.Briefly,precoatedmicroplates(withmonoclonalmouseanti-humanantibodyagainsthsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10orRANTES)weresuccessivelysubjecttotheblockagewith2%BovineSerumAlbumin(BSA;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),totheinoculationwiththeserially-dilutedstandardsserumsamplesorcellsupernatantsamplesandthentotheinoculationwiththepolyclonalantibodysolutionagainsthsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10orRANTESconjugatedwithhorseradishperoxidase).Finally,theopticaldensityofeachwellwasdeterminedimmediatelyat450nm.4.QuantitativeanalysisofIL-1βorTNF-αmRNAwithRT-qPCRCellularmRNAsamplesinMG-63cellswereisolatedwiththeTRIzolreagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)accordingtothemanufacturer’smanual,andweresupplementedwiththeRNasin®PlusRNaseInhibitor(Promega,Madison,WI,USA),andwerestoredat-80°Cbeforeuse.RT-qPCRassayforeachmRNAsamplewasperformedwiththeSYBRgreenOneStepRT-PCRKit(Takara,Tokyo,Japan)accordingly.PrimersforTNF-α(PF:5'-TCTCATCAGTTCTATGGCCC-3',PF:5'-GGGATGAGACAAGGTACAAC-3'),IL-1β(PF:5'-AAGCTGAGGAAGATGCTG-3',PR:5'-ATCTACACTCTCCAGCTG-3')orβ-actin(PF:5'-TGTACGCCTCTGGCCGTACC-3',PR:5'-GATGGGCACAGTGTGGGTGA-3')weresynthesizedbySangonBiotechCompany(Shanghai,China).Eachreactionwasperformedin20µLcontaining4µL5xRT-PCRBuffer,113 重庆医科大学博士研究生学位论文µLdNTPMix(containing10mMofeachdNTP),2µLRNA,0.5µLforward/reverseprimer(10µM),0.5µLRNaseinhibitor(Promega,Madison,WI,USA),andwassupplementedwithRNase-freewatertoatotalvolumeof20µL.RT-qPCRreactionwasperformedasfollowing:Forthereversetranscription,thereactionwasranat42°Cfor5minutesand95°Cfor10seconds;fortheapplication,thereactionwasranfor40cyclesof95°Cfor5secondsand60°Cfor20seconds.RelativelevelofTNF-αorIL-1βwascalculatedby∆∆Ctmethod,withβ-actinascontrol[27].5.WesternblottinganalysisTotalcellularproteinsampleswerepreparedwithaCellLysisBuffer(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)accordingtothemanualandsupplementedwithaproteaseinhibitorcocktail(Pierce,Rockford,IL,USA).FortheCytochromecreleaseassay,thecytoplasmicproteinwasisolatedbytheMitochondria/CytosolFractionationKit(Abcam,Cambridge,UK)accordingtothemanufacturer’smanual.Eachproteinsamplewasseparatedby12%SDS-PAGEgel(withaloadingamountof30μgforeachsample)andwastransferredonnitrocellulosemembrane(Millipore,Bedford,MA,USA).Themembramewassuccessivelyblockedovernightwith3%BSAinTris-bufferedsalinecontaining0.05%Tween20(TBST),incubatedwiththefirstantibody(Cytochromec,Caspase3,Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP),orβ-actin)for1houratroomtemperatureorovernightat4°C,andthenfollowedbytheincubationwith14 重庆医科大学博士研究生学位论文HRP-conjugatedgoat-anti-rabbitsecondaryantibody(Pierce,Rockford,IL,USA).Three-timewashingofthemembranewasnecessarybeforeeachinoculation,specificbindingbandwasdetectedbyECLkit(AmershamPharmaciaBiotech,Amersham,UK).Results:1.Upregulationofpro-inflammatorycytokinesintheT2DMpatientswithbonefractureToinvestigatethepromotiontopro-inflammatorycytokinesandchemokinesinT2DMpatientswithbonefracture,weexaminedtheserumlevelsofhs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10andRANTESinT2DMpatientswithorwithoutbonefracture(Tibialfracture,fractureoftibiaandfibula,orfemoralfracture).Thenon-T2DMpatientswithbonefracturewerealsoincluded.Itwasshownintable1,thattherewasnosignificantdifferenceinageandgenderamongthethreegroupsofpatients;andtherewasneithersignificantdifferenceinBodyMassIndex(BMI),diabetesmellitus(DM)duration,fastingglucoseandotherDM-associatedcharacteristics.However,asshowninFigure1A-D,thelevelofhsCRP)wassignificantlyhigherinthegroupofT2DMpatientswithfracture,thanintheT2DMcontrolpatients(p<0.0001)orthaninfracturedpatientswithoutT2DM(p<0.01).Moreover,therewasalsosignificantdifferenceintheserumproinflammatorycytokinessuchasTNF-α,IL-1βandIL-6betweenT2DMpatientswithfractureandT2DMcontrolpatients,orbetweentheT2DMpatientswithfractureand15 重庆医科大学博士研究生学位论文fracturedpatientswithoutT2DM.ThedifferenceinIL-1β(p<0.01orp<0.05),TNF-α(p<0.001orp<0.01)orIL-6(p<0.001orp<0.05)wasalsosignificant.Inaddition,theserumlevelsofIP-10andRANTESwerealsosignificantlyhigherinthebone-fracturedT2DMpatients(p<0.01orp<0.001,comparedwithT2DMcontrolpatientsorwithfracturedpatientswithoutT2DM,Figure2Eand2F)Thus,weconfirmedthehighpromotionofproinflammatorycytokinesandchemokinesinT2DMpatientswithbonefracture.2.HighglucoseinducesTNF-αandIL-1βinhumanosteoblast-likeMG-63cellsTofurtherdeterminethepromotiontopro-inflammatorycytokinesbyhighglucoseinhumanosteoblastcells,wethenexaminedthepromotiontoTNF-αandIL-1βinbothmRNAandproteinlevels.MG-63cellsweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8(formRNAassay)or12(forproteinassay)hours,andthemRNAorproteinlevelofTNF-αandIL-1βwasevaluatedbyRT-qPCRorbyELISA.Figure2AdemonstratedthatthemRNAlevelofTNF-αwassignificantlyupregulatedto1.680±0.1589orto2.823±0.2751bythetreatmentwith20(Column3vscolumn1,p=0.0203)or40mM(Column4vscolumn1,p=0.0032)D-glucose,withadose-dependence(Column4vscolumn3,p=0.0228).AndtheIL-1βmRNAwasalsosignificantlypromotedto2.847±0.1775orto4.574±0.4457bytheD-glucosetreatmentwithaconcentrationof20(Column3vscolumn1,16 重庆医科大学博士研究生学位论文Figure2B,p=0.0007)or40mM(Column4vscolumn1,Figure2B,p=0.0004),alsodose-dependently(Column4vscolumn3,Figure2B,p=0.0226).Andtheproteinlevelsofbothcytokineswerealsoupregulatedthehighglucose.ItwasshowninFigure2Cand2DthattheTNF-αandIL-1βinthesupernatantofMG-63cellsweremarkedlyupregulatedbyeither20or40mMD-glucose(p<0.05,p<0.01orp<0.001),withadose-dependence(p<0.05orp<0.01).Conclusion:1.Inpatientswithtype2diabetesbeforethechangingruleoftheinflammatoryfactorsandchemokinesforfracturesinpatientswithtype2diabetesinserumhs-CRP,TNFalpha,beta,IL-1IL-6,IP-10andthecontentofRANTESisgreaterthanthetype2diabeticpatientswithoutfracture,theformertwoisgreaterthanthefracturepatientswithoutdiabetes.2.TNFalphaandbetaIL-1inthemRNAandproteinlevels,asosteoblastsculturedglucoselevelshigherandhigher,including40mMglucosegroupishighest,followedby20mMglucosegroupandcomparisonbetweendifferentconcentrationgroups,thedifferenceisstatisticallysignificant.TNFalphaandbetaIL-1mRNAcontentandmeasuringdependenciestotheconcentrationofglucose.Keywords:Type2diabetes;Osteoblasts;Fracture;Inflammatorychemokines;Tumornecrosisfactoralpha;Interleukin1beta;mRNA17 重庆医科大学博士研究生学位论文Section2HighsugarinterferewithtumornecrosisfactoralphainvitromediatedosteoblastapoptosismechanismresearchObjective:TestunderdifferentconcentrationsofglucoseinterfereswiththetumornecrosisfactoralphaosteoblastinducedapoptosisofMG-63rule,andbythemethodsofgeneknockouttheknockoutosteoblastTNFalphapieces,detectingtheexpressionofosteoblastapoptosisandapoptosisrelatedfactorinfluence,forthestudyofpatientswithtype2diabetesTNFalpharoleinthefracturehealingprocess,themolecularmechanismoffracturehealingdrinkbasisforpreventionandcure.Methods:1.CellsmediumandreagentsHumanMG-63osteoblast-likecellswereprovidedbythecellresourcecenterofChineseacademyofmedicalsciences(Beijing,China)andwereculturedinEagle'sminimalessentialmedium(EMEM)(GIBCO,Rockville,MD,USA),supplementedwith2mMGlutamine(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO,USA),1%NonEssentialAminoAcids(NEAA)(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)and10%fetalbovineserum(FBS)(Gibco,Rockville,MD,USA).Thecellswereincubatedat37°C,with5%CO2.D-glucoseandTNF-αwerepurchasedfromSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)andweredissolvedinEMEMwith2%18 重庆医科大学博士研究生学位论文FBS.2.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)forcytokinesSerumorsupernatantlevelsofhsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10andRANTESwerequantitativelyexaminedwiththesolidphaseenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kit(Abcam,Cambridge,UK)undertheguidanceofproduct’smanual.Briefly,precoatedmicroplates(withmonoclonalmouseanti-humanantibodyagainsthsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10orRANTES)weresuccessivelysubjecttotheblockagewith2%BovineSerumAlbumin(BSA;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),totheinoculationwiththeserially-dilutedstandardsserumsamplesorcellsupernatantsamplesandthentotheinoculationwiththepolyclonalantibodysolutionagainsthsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10orRANTESconjugatedwithhorseradishperoxidase).Finally,theopticaldensityofeachwellwasdeterminedimmediatelyat450nm.3.WesternblottinganalysisTotalcellularproteinsampleswerepreparedwithaCellLysisBuffer(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)accordingtothemanualandsupplementedwithaproteaseinhibitorcocktail(Pierce,Rockford,IL,USA).FortheCytochromecreleaseassay,thecytoplasmicproteinwasisolatedbytheMitochondria/CytosolFractionationKit(Abcam,Cambridge,UK)accordingtothemanufacturer’smanual.Eachproteinsamplewasseparatedby12%SDS-PAGEgel(withaloadingamountof3019 重庆医科大学博士研究生学位论文μgforeachsample)andwastransferredonnitrocellulosemembrane(Millipore,Bedford,MA,USA).Themembramewassuccessivelyblockedovernightwith3%BSAinTris-bufferedsalinecontaining0.05%Tween20(TBST),incubatedwiththefirstantibody(Cytochromec,Caspase3,Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP),orβ-actin)for1houratroomtemperatureorovernightat4°C,andthenfollowedbytheincubationwithHRP-conjugatedgoat-anti-rabbitsecondaryantibody(Pierce,Rockford,IL,USA).Three-timewashingofthemembranewasnecessarybeforeeachinoculation,specificbindingbandwasdetectedbyECLkit(AmershamPharmaciaBiotech,Amersham,UK).4.MTTassayandCellapoptosisassayMTTassay(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)wasperformedforthecellularviabilityanalysis.MG-63cellsseededin96-wellplateswithapproximately85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucose,or(and)with5,10,20or40ng/mLTNF-αfor24,48or72hours.Theneachcellwellwasaddedwith10μLMTTsolutionandtheplatewasincubatedat37°Cfor4hours.Postadding100μLDMSOintoeachwelltodissolvetheformazan,theabsorbancewasmeasuredonanELISAplatereaderwithatestwavelengthof570nmandareferencewavelengthof630nmtoobtainsamplesignal(OD570-OD630).TheapoptosisofMG-63cellswasassayedwithanannexinV-FITCapoptosisdetectionkit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA).Inbrief,20 重庆医科大学博士研究生学位论文approximate1×106cellsposttreatmentwerestainedwithannexinV-FITCandpropidiumiodide,andthenapoptoticcellsweredetectedbyaFACScanflowcytometer(BDBiosciences,SanJose,CA,USA).Theapoptosislevelwasevaluatedbyapercentageofapoptoticcellstototalcells.5.StatisticalanalysisStatisticalanalysiswasperformedusingGraphPadPrism6(GraphPadSoftware,LaJolla,CA,USA).Statisticalevaluationsarepresentedasmean±SE.DatawereanalyzedusingtheStudent’sttestorbyone-wayANOVAtest,postconfirmingthenormally-distributeddatawithShapiro-Wilktest.Apvalue<0.05orlesswasconsideredstatisticallysignificant.Results:1.TNF-αreducesviabilityinMG-63cellsinthepresenceofhighD-glucoseWesupposedapossibleinfluenceontheviabilityofosteoblastsbyTNF-αandhighglucose.TheviabilityofMG-63cellswhichweretreatedwithTNF-αandD-glucosewitharangeofconcentrationswereexaminedbyMTTassay.ItwasindicatedinFigure3AthattheviabilityofMG-63wassignificantlyreducedbytheD-glucosetreatmentwith40mMfor24hours.AndtheviabilityreductionwasalsoinducedbytheTNF-αtreatmentwith20or40ng/mL(p<0.05respectively).Furthermore,theviabilityreductionofMG-63cellswasmoresignificantbytheTNF-αtreatment,inthepresenceofD-glucose.Figure3BdemonstratedthattheTNF-αtreatmentwith10ng/mL21 重庆医科大学博士研究生学位论文significantlyreducedtheviabilityofMG-63cells,inthepresenceof20mMD-glucose(p<0.05).AndtheviabilityreductionwasmoresignificantbytheTNF-αtreatmentwith20or40ng/mL,inthepresenceof20mMD-glucose(p<0.001respectively),dose-dependently.TofurtherdeterminethecellviabilityreductionbythetreatmentwithTNF-αandD-glucose,wecurvedtheviabilityofMG-63cells,whichweretreatedwith5mMD-glucose(ascontrol),20mMD-glucose,20ng/mLTNF-α,orbothwith20mMD-glucoseand20ng/mLTNF-α.Figure3CindicatedthattherewasnosignificantdifferenceintheviabilitycurvebetweentheMG-63cellstreatedwith20mMD-glucoseandtheMG-63cellstreatedwith20ng/mLTNF-α.However,theviabilityofTNF-α-treatedMG-63cellswassignificantlylowerat48or72hourposttreatment.Furthermore,thecellularviabilitydecreasedmoresignificantlyinthecombinationtreatmentgroup(p<0.01orp<0.001)2.TNF-αpromotesapoptosisandupregulatesapoptosis-associatedmarkersinMG-63cellsinthepresenceofhighD-glucoseGiventhesignificantapoptosisinductionbyTNF-αinosteoblastcells,wethendeterminedtheapoptosisinductioninMG-63cellsbyTNF-α,inthepresenceofD-glucose.TheapoptosisinductionbythesingulartreatmentwithD-glucoseorTNF-α,orbythecombinedtreatmentwithbothagentswasassayed.Figure4demonstratedthatthe20mMD-glucosedidnotinducesignificantapoptosisinMG-63cells,comparedtothecontrolMG-6322 重庆医科大学博士研究生学位论文cells(5mMD-glucose),whereasthetreatmentwith20ng/mLTNF-αpromotedsignificantlyhigherlevelofapoptosisat24or48hourposttreatment(p<0.05orp<0.01).Furthermore,thereweremoreapoptoticcellsinthecombinedtreatmentgroup(p<0.05respectively,comparedtotheTNF-αtreatment).Thenweanalyzedinthefourgroupsofcells,theapoptosis-associatedmarkers,suchasreleasedcytochromec,cleavedcaspase3andlyzedPARP,byactivatedcaspase3bywesternblotanalysis.ItwasshownthatD-glucosewith20mMhadnoregulationonthecytochromecrelease,caspase3activationandPARPlysis,whereasallofwhichwerepromotedby20ng/mLTNF-α(p<0.05orp<0.01).Furthermore,thetreatmentwith20mMD-glucosecouldaggravatedtheapoptosisinductionby20ng/mLTNF-α(p<0.05orp<0.01,comparedtotheTNF-αgroup,).Therefore,thehighglucosesynergizestheapoptosispromotionbyTNF-αinMG-63cells.Conclusion:1.TheglucoseandtumornecrosisfactoralphaandosteoblastMG-6energymeteringdependence.2.D-glucosecompoundTNFalphainterferenceosteoblastafter48and72,vigorsignificantlydecreased.3.Thetumornecrosisfactoralpha+glucosegroupofosteoblastapoptosisratethanwithsimpleinterferencegroup.4.Thetumornecrosisfactoralpha+glucosegroupleadtoosteoblast23 重庆医科大学博士研究生学位论文apoptosisrelatedproteinscytochromec,cleavedcaspase3proteinandlyzedPARPproteincontentissignificantlygreaterthanwithsimpleinterferencegroup.Keywords:type2diabetes;Osteoblasts;Fracture;Tumornecrosisfactoralpha;Apoptosisrelatedproteins;Thecellvitality;apoptosis24 重庆医科大学博士研究生学位论文2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调及体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究前言随着我国社会经济的迅速发展和人民生活水平的提高，糖尿病成为我国人群患病率最高的慢性病[1]，据不完全统计，2014年我国的糖尿病人群为1.48亿[2]，近年来尤其是民众家用轿车的保有量迅猛增长，交通事故伤尤其是导致的骨折病例急剧增多，而糖尿病患者骨折周围高糖内环境会导致骨折不愈合和愈合缓慢，其具体机制尚不明确[3]。骨折愈合过程较为复杂，受多种因素和局部微环境多层次的调节和影响，任何过程被干扰或阻断，均会影响到骨折的愈合的速度和效果[4]。例如软组织及周围结构严重的骨折，通常会伴随骨折断端血管及神经的损伤，在骨折修复过程中，骨折断端周围的缺血、缺氧和周围组织的炎症反应，均会影响骨折愈合的时间和程度，临床也经常出现骨折断端周围环境缺氧和炎症反应而未及时处理导致骨折愈合不良，骨折不愈合或者是延迟愈合[5]，不但会给患者带来不必要的痛苦，也会给社会和家庭带来巨大的经济负担，因此，研究骨折不愈合的因素，如何人为的从外界通过药物或手术干扰促进骨折愈合成为临床急需解决的问题。骨折愈合主要分为诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和重建期，骨折愈合中阻碍任何一个环节均会影响骨折的愈合[6]。骨折愈合参与的细胞较多，不同阶段均有不同细胞参与，开放性骨折常伴有细菌感染，而细菌感染释放的毒素就会干扰或者损伤骨折愈合相关细胞的正常代谢和功能，从而阻断骨折愈合的过程，因此细菌感染是骨折不愈合或延迟愈合的主要的原因之一[7]。骨折愈合的过程就是成骨细胞形成骨质并钙化，细菌导致局部炎症介质释放，最终引起免疫反应导致成骨细胞坏死或者凋亡，造成成骨功能障碍，最终导致不愈合[8]。骨折发生后，在各种炎症因子和其他细胞因子的作用下，骨折附近骨髓的间充质干细胞分化发育成成骨细胞，其转化和分化的过程调节非常精密复杂，其作用机制如何，近年来有相关报道[9]，有学者发现，闭合性骨折断端runt相关的转录因子-2及骨钙蛋白的水平增高，也有研究发现[10]，如果实验动物敲除了runt相关25 重庆医科大学博士研究生学位论文的转录因子-2，其成骨细胞水平降低，骨折愈合困难，因此我们可以初步认为runt相关的转录因子-2作为启动骨髓间充质干细胞的钥匙，有研究发现，runt相关的转录因子-2信号通路的激活与BMP受体激活导致的细胞内磷酸化相关，而前者正是形成骨钙蛋白刺激成骨的关键因素[11-16]。糖尿病本身是一个多器官受高血糖影响的全身性疾病，高血糖不利于成骨细胞分化，导致骨质疏松容易诱发骨折，同时骨折后又由于高血糖导致骨折断端周围微血管功能较差，不能为骨折修复提供充足的营养，同样可以引起骨折不愈合[17-23]。因此临床糖尿病患者骨折后由于血糖控制不理想导致的骨不连、假关节的形成和延迟愈合较为多见[24]。因此如果能从分子机制上研究糖尿病骨折不愈合的因素对于提高糖尿病患者骨折治疗的疗效具有重要的意义和价值。有研究发现糖尿病可以促进核因子kapaB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[25]，信号通路从而激活破骨细胞功能和促进骨吸收而糖尿病促进破骨细胞分化抑制了糖尿病骨折病人的骨折愈合，因此，糖尿病患者骨折愈合较为缓慢甚至不愈合，临床处理比较棘手。有研究发现，糖尿病骨折愈合中重要的机制是肿瘤坏死因子水平上调，而上调的肿瘤坏死因子可诱发糖尿病患者神经、心血管、视网膜及炎症副反应，除了肿瘤坏死因子，白细胞介素1β和白细胞介素6也会因为糖尿病的严重程度增高，有研究发现，白细胞介素1β可以通过肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6损伤胰腺β-细胞[26-28]，同时TNF-α和IL-6可以促进糖尿病患者的胰岛素抵抗，加重糖尿病的病情。肿瘤坏死因子被认为与骨吸收和炎症密切相关，大量的研究证实，肿瘤坏死因子诱导的金属基质蛋白-9不仅会影响破骨细胞分化和骨质破坏，而且可以作用于成骨细胞和骨祖细胞，影响其分化与转化[29-32]。肿瘤坏死因子-α可以促进骨折周围的炎症反应，也是参与炎症反应的主要介质，糖尿病小鼠模型中，高水平的肿瘤坏死因子-α可以加速骨折周围骨质丢失，在体外肿瘤坏死因子能促进成骨类细胞凋亡[33，34]，但是其诱导成骨细胞凋亡的机制尚不清楚。因此本文通过检测2型糖尿病患者骨折后静脉血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量，并与非糖尿病骨折患者和糖尿病非骨折患者比较，为研究2型糖尿病患者炎症因子及趋化因子在骨折愈合过程中的作用垫定基础；通过检测在不同浓度葡萄糖干扰下肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞MG-63活性的影26 重庆医科大学博士研究生学位论文响的规律同时检测对成骨细胞凋亡和凋亡相关因子表达的影响，为研究2型糖尿病患者TNF-α在骨折愈合过程中的作用分子机制，及防治骨折不愈合奠基础。参考文献[1]Horst,K.,Eschbach,D.&Pfeifer,R.,etal.Localinflammationinfracturehematoma:resultsfromacombinedtraumamodelinpigs.MediatorsInflamm2015,12：6060.[2]Kim,J.Y.,Park,J.S.&Strassheim,D.,etal.HMGB1contributestothedevelopmentofacutelunginjuryafterhemorrhage.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2005，288：L958-L965.[3]Kolar,P.,Schmidt-Bleek,K.&Schell,H.,etal.Theearlyfracturehematomaanditspotentialroleinfracturehealing.TissueEngPartBRev，2010，16：427-434.[4]Liu,Y.,Yan,W.&Tohme,S.,etal.HypoxiainducedHMGB1andmitochondrialDNAinteractionsmediatetumorgrowthinhepatocellularcarcinomathroughToll-likereceptor9.JHepatol,2015,63:114-121.[5]Livak,K.J.&Schmittgen,T.D.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method.Methods.2001,25:402-408.[6]McKibbin,B.Thebiologyoffracturehealinginlongbones.JBoneJointSurgBr.1978,60-B:150-162.[7]Naik,A.A.,Xie,C.Zuscik,M.J.,etal.ReducedCOX-2expressioninagedmiceisassociatedwithimpairedfracturehealing.JBoneMinerRes.2009,24:251-264.[8]Palmblad,K.,Schierbeck,H.Sundberg,E.,etal.Highsystemiclevelsofthecytokine-inducingHMGB1isoformsecretedinseveremacrophageactivationsyndrome.MolMed,2014,20:538-547.[9]Park,J.S.,Gamboni-Robertson,F.He,Q.,etal.Highmobilitygroupbox1proteininteractswithmultipleToll-likereceptors.AmJPhysiolCellPhysiol.2006,290:C917-C924.[10]Park,J.S.,Svetkauskaite,D.He,Q.,etal.Involvementoftoll-likereceptors2and427 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重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调机制的相关研究骨折的愈合受多种因素和多个环节的影响，其主要分为诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和重建期，骨折愈合中阻碍任何一个环节均会影响骨折的愈合。骨折发生后，在各种炎症因子和其他细胞因子的作用下，骨折附近骨髓的间充质干细胞分化发育成成骨细胞，其转化和分化的过程调节非常精密复杂，其作用机制如何，尚不清楚[1-4]。随着我国生活水平的提高，糖尿病患者的发病率逐年提高，与高血压共同成为我国患病人群最大的慢性病之一。糖尿病主要病理特显就是血糖增高，高血糖对全身各器官微血管都有损伤作用，例如长期慢性糖尿病会导致视网膜微血管出血、肾血管损伤会导致慢性肾衰竭及神经系统疾病[5]，因此，糖尿病是一种多器官受累的疾病，对于糖尿病患者同样易导致骨质疏松，同时诱发骨折，同时骨折后又由于高血糖导致骨折断端周围微血管功能较差，不能为骨折修复提供充足的营养，同样可以引起骨折不愈合[6]。因此临床糖尿病患者骨折后由于血糖控制不理想导致的骨不连、假关节的形成和延迟愈合较为多见。因此如果能从分子机制上研究糖尿病骨折不愈合的因素对于提高糖尿病患者骨折治疗的疗效具有重要的意义和价值。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为人类巨噬细胞分泌的具有杀伤性特征的因子早在上个世纪80年代，就被有关学者发现，其主要作用为促进免疫应答和免疫因子的分泌，刺激成纤维细胞的修复与增值，促进凝血因子及组织因子的活性等[7]。对于骨折成骨，有学者研究发现肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路从而激活破骨细胞功能和促进骨吸收，而糖尿病促进破骨细胞分化抑制了糖尿病骨折病人的骨折愈合，因此，糖尿病患者骨折愈合较为缓慢甚至不愈合，临床处理比较棘手[8]。有研究发现，糖尿病骨折愈合中重要的机制是肿瘤坏死因子水平上调，而上调的肿瘤坏死因子与诱发糖尿病患者神经、心血管、视网膜及炎症副反应，除了肿瘤坏死因子，白细胞介素1β和白细胞介素6也会因为糖尿病的严重程度增高[9]，有研究发现，白细胞介素1β可以通过肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6损伤胰腺β-细胞，同31 重庆医科大学博士研究生学位论文时TNF-α和IL-6可以促进糖尿病患者的胰岛素抵抗，加重糖尿病的病情。因此部分主要通过检测2型糖尿病患者骨折后静脉血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10andRANTES的含量，并与非糖尿病骨折患者和糖尿病非骨折患者比较，为研究2型糖尿病患者炎症因子及趋化因子在骨折愈合过程中的作用垫定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1实验试剂人类成骨细胞MG-63中国医学科学院提供Dulbecco'sModifiedEagle'sMediumGibco,Rockville,MD,USA(EMEM)0%的胎牛血清GIBCO,Rockville,MD,USA聚丙烯酰胺凝胶金斯瑞生物技术有限公司二甲苯溶液美国BD北京百泰克生物技术有限公司公司聚偏二氟乙烯膜北京众益中和生物技术有限公司100mg/mL的链霉素哈尔滨制药有限公司NonEssentialAminoAcids(NEAA)ThermoScientific,Rockford,IL,USAGlutamineSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAPBS缓冲液北京万华生物技术有限公司CellLysisBufferCellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA150mMNaCl北京达科生物技术有限公司1%NP-40SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USASigma-AldrichSt.Louis,MO,USA亚硫酸氢钠金斯瑞生物技术有限公司32 重庆医科大学博士研究生学位论文TotalNucleicAcidIsolationKit试剂盒Ambion,Austin,TX,USASYBRGreenPCRKits试剂盒TaKaRa,Tokyo,JapanThermoOneStepRT-PCR试剂盒RocheDiagnostics,Mannheim,GermanyFBSGibco,Rockville,MD,USADNA引物上海生工公司合成管家基因β肌动蛋白Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USAD-glucoseSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)TNF-αSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)引物SangonBiotechCompany(Shanghai,China)DMSOCellSignalingTechnologyInc.(Danvers,MA,USA培养板北京赛因坦科技有限公司enzyme-linkedimmunosorbentassayAbcam,Cambridge,UK(ELISA)kit1×Binding缓冲液上海信裕生物技术有限公司BovineSerumAlbuminSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA100mg/mL青霉素石家庄药业有限公司lipofectamine2000Invitrogen,Carlsbad,CA,USAskimmedmilkSolarbio,Beijing,ChinaTRIzolreagentInvitrogen,Carlsbad,CA,USARNasin®PlusRNaseInhibitorPromega,Madison,WI,USAThermo蛋白抽提试剂盒FisherScientific,Waltham,MA,USA硝酸纤维素膜Promega,Madison,WI,USARNaseinhibitor蛋白酶抑制剂Abcam,Cambridge,UKAbcam,BCAProteinAssayReagentKitCambridge,UKp65兔多克隆抗体Abcam,Cambridge,UK33 重庆医科大学博士研究生学位论文IκBSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAPierce,Rockford,IL,USA内参β-actinSinobio,Abcam,Cambridge,MA,USASantaCruzBiotechnology,SantaCruz,辣根过氧化物酶羊抗兔抗体CA,USAβ-actinSinobio,Beijing,ChinaPierce,Rockford,IL,USAproteaseinhibitorcocktailBio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)Abcam,Cambridge,UKMitochondria/CytosolFractionationKitAmershamPharmaciaBiotech,ECLkitAmersham,UK1.1.2实验仪器移液器配套枪头北京北大维信生物科技有限公司全自动酶标北京北大维信生物科技有限公司DNA电泳槽北京北大维信生物科技有限公司高速离心机北京北大维信生物科技有限公司电热恒温水槽北京北大维信生物科技有限公司凝胶成像仪北京北大维信生物科技有限公司微量移液器恒温培养箱北京北大维信生物科技有限公司恒温摇床北京北大维信生物科技有限公司PCR仪PCR仪北京北大维信生物科技有限公司移液器配套枪头北京北大维信生物科技有限公司凝胶成像分析系统北京六一仪器厂水平电泳仪仪北京北大维信生物科技有限公司正置荧光显微镜奥林巴斯公司，东京细胞刮北京北大维信生物科技有限公司细胞培养瓶北京北大维信生物科技有限公司34 重庆医科大学博士研究生学位论文细胞培养板北京北大维信生物科技有限公司微量上样器北京北大维信生物科技有限公司盖玻片北京北大维信生物科技有限公司普通冰箱海尔公司滤纸北京北大维信生物科技有限公司PCR反应联排管北京北大维信生物科技有限公司离心管北京北大维信生物科技有限公司载玻片北京北大维信生物科技有限公司微量离心管北京北大维信生物科技有限公司制冰机海尔公司移液管艾本德中国上海有限公司稳压电泳仪MajorScience公司电子天平奥豪斯美国有限公司去离子水机上海和泰公司超低温冰箱艾本德中国上海有限公司超纯水系统诺克尔过滤(苏州)有限公司精密电子天平梅特勒-托利多公司超低温冰箱艾本德中国上海有限公司生物安全柜广州市深华生物技术有限公司冻存管艾本德中国上海有限公司1.2方法1.2.1病例选择和炎症因子的检测自2014年9月-2015年10月在内蒙古医科大学第二附属医院骨科就诊的患者中，随机选取28例二型糖尿病骨折患者（其中6例胫骨骨折，11例胫腓骨骨折，11例股骨骨折），同时选取25例非2型糖尿病骨折患者（其中4例胫骨骨折，12例胫腓骨骨折，9例股骨骨折）作为对照组1；另外选取22例糖尿病非骨折患者；全部患者在进行研究前均签署患者知情同意书，全部实验过程通过内蒙古医科大学第二附属医院伦理委员会伦理审核。三组患者均在接诊后立刻抽取静脉血标本。35 重庆医科大学博士研究生学位论文全血标本离心分离血清，按照说明书操作步骤利用酶联免疫吸附试验定量测量hsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES，其主要操作有，孵育酶标板，分别加入三组的血清，并依次加入封闭液，牛血清，标准血清，分别加入hsCRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES辣根过氧化物酶的多克隆抗体，最后在450nm波长下，用分光光度计测量其OD值。1.2.2成骨细胞培养与D-glucose和TNF-α干扰模型的造模人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham'sF12的基质和Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养液中培养，培养液中添加2.5mM左旋谷酰胺和0.3mg/mlG418(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)，并且添加10%小牛血清hFOB1.19细胞在5%CO2，37°C环境下温箱中培养。高糖环境造模方法，将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α，以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。1.2.3RT-PCR法检测TNF-α和IL-1βmRNA的含量依据产品说明书，用TRIzolreagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂盒提取MG-63的mRNA，先将成骨细胞样本用1毫升Trizol试剂匀质，总mRNA用Trizol试剂进行分离(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。使用强力匀质机（Polyriontissumizer，上海华邻实业有限公司），匀质样本体积不应超过Trizol试剂的10%，转移匀质化的溶液到新管，加入氯仿进行分离。将匀质液至于30℃孵育5分钟，从而使核蛋白体完全分离，每毫升Trizol试剂添加0.2毫升氯仿，盖好样品管，大力摇晃15秒，再孵育2-3分钟，8℃12000*g离心15分钟，RNA存在于上层的无色水相，提取水相。将水相转移到新管，混合异丙醇以从水相中沉淀RNA，异丙醇与Trizol试剂比例为1:0.5,30℃孵育10分钟，8℃12000*g离心15分钟，离心后RNA沉淀于管侧壁及底部，呈凝胶状。RNA洗涤：遗弃上清液，用75%乙醇洗涤RNA一次，加入Trizol试剂，与乙醇的比例为1:1，充分混合，8℃7500*g离心5分钟。重新溶解RNA，简单干燥RNA沉淀，部分溶解RNA样品，在无RNA酶的水中吹打5次，并在55℃-60℃孵育10分钟，再用100%甲醛胺再溶解并保存于-70℃。并滴加核糖核酸酶抑制剂SUPERase•In™(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)1μl最后添加1μlRNasin®PlusRNaseInhibitor的终止液，用TakaraOneStep36 重庆医科大学博士研究生学位论文RT-PCTkit检测TNF-α和IL-1βmRNA的含量，TNF-α(PF:5'-TCTCATCAGTTCTATGGCCC-3',PF:5'-GGGATGAGACAAGGTACAAC-3'),IL-1β(PF:5'-AAGCTGAGGAAGATGCTG-3',PR:5'-ATCTACACTCTCCAGCTG-3')和β-actin(PF:5'-TGTACGCCTCTGGCCGTACC-3',PR:5'-GATGGGCACAGTGTGGGTGA-3')，按下列比例配置反应体系：试剂每管加入量上游引物（5µM）0.5µl下游引物（5µM）0.5µlcDNA1.0µl水8.0µl设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，15S，之后每一步变性95℃，5S，退火延伸60℃，30S，共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。Cycle1:(1X)Step1:95.0℃for00:15Cycle2:(45X)Step1:95.0℃for00:05Step2:60.0℃for00:30通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析Real-TimePCR定量结果。Real-TimePCR仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过程中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，荧光值将降低并被仪器监测到。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30S,同时读取吸光值。Cycle3:(1X)37 重庆医科大学博士研究生学位论文Step1:95.0℃for01:00Cycle4:(1X)Step1:55.0℃for01:00Cycle5:(81X)Step1:55.0℃-95.0℃for00:30∆∆Ct法定量测量TNF-α和IL-1β比β-actin的相对量。1.2.4免疫印迹法法检测TNF-α和IL-1β蛋白的含量参照细胞浆的蛋白用和细胞裂解液(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白，并辅以一蛋白酶抑制剂（罗氏生化试剂盒，巴塞尔，瑞士）。细胞总蛋白的提取药物作用不同时间后，弃去培养基，PBS液洗一次，将细胞粉碎后加入1ml的PBS中1000rpm，4℃离心5min。倾去上层液体，非变性蛋白裂解液裂解组织细胞，冰上静置25min，12000rpm，4℃，离心15min，收集上清可溶性蛋白组分，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。BCA法测定蛋白，用裂解液将蛋白调整至相同浓度，l：4比例加入5上样缓冲液后,97℃沸水浴5min，冷却后电泳上样。胞浆-核蛋白的提取用胞浆-胞核蛋白抽提试剂盒提取细胞核和细胞浆蛋白。处于对数生长期的细胞,以5×105/瓶接种到25cm2培养瓶中,培养24h,加入谷氨酰胺（时间效应关系研究中加谷氨酰胺4mM,分别于给药后0，6，12，24，48h收集细胞,检测TNF-α和IL-1β蛋白表达。吸出上清液,用预冷的PBS将细胞洗涤1次，800rmp,4℃离心5min,弃上清。估计离心后的细胞体积,加入5倍体积的胞浆裂解液。涡旋混合仪剧烈振荡30s,冰上放置15min,并每隔5min在涡旋混合仪上振荡15s,1000rmp,4℃离心5min。沉淀为核粗提物,上清则是胞浆蛋白。尽快将上清转入另一预冷的离心管中,12000rmp,4℃离心5min,得胞浆蛋白,一70℃保存。沉淀用100ulul胞浆裂解液洗涤一次,加入20ul核蛋白裂解液,最大转速涡旋剧烈振荡15s,冰上放置30min,每隔10min涡旋振荡15s,12000rmp,,4℃离心5min,上清即为所提核蛋白。考马斯亮蓝定蛋白,用裂解缓冲液调整蛋白浓度一致,-70℃。38 重庆医科大学博士研究生学位论文丙烯酰胺凝胶灌制①安装玻璃板。②将配置好的分离胶溶液迅速灌注于玻璃板的间隙中，留出浓缩胶所需空间，用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水。③分离胶聚合完全后（30分钟），倒出覆盖层液体，可用滤纸的边缘吸净残留液体。④在已聚合的分离胶上直接灌注已配置好的浓缩胶，长度是0.5-1cm，立即插入干净的梳子，避免混入气泡，30分钟左右聚合完成。蛋白电泳①将定量后的蛋白样品从-80℃取出，融化之后加入1/4体积的5×LoadingBuffer，震荡混匀并离心。②将混匀的蛋白样品在沸水中煮5分钟，取出并离心备用。③把提前配置好的凝胶固定于电泳装置上，上、下槽中均加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。取出小梳子后，用注射器的针头冲洗加样槽，除去未聚合的丙烯酰胺，必须设法排出凝胶底部的气泡。④按预定顺序加样。每加完一个样品应在缓冲液中洗涤注射器，或更换枪尖。⑤正确连接电极。浓缩胶电压80V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到100-120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。⑥撬开玻璃板，取出凝胶，切下凝胶的一角做出方位标记。蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体①膜的选择：目的蛋白分子量150kDa，选用硝酸纤维素膜（NC膜）。②膜的预处理：在电泳结束前剪裁滤膜和滤纸，其大小应与凝胶完全吻合。把剪裁好的硝酸纤维素膜漂浮于一盘1×转移缓冲液的液面上，待其从下往上湿润后，将之浸没于其中，浸泡5分钟以上以祛除滤膜上的气体。滤纸同样浸泡于1×转移缓冲液中平衡。③制作膜胶夹心：小心除尽凝胶与膜，以及与滤纸之间的气泡。单侧滤纸是4层，即滤纸、膜、胶、滤纸。④在恒压65V下转移三小时。⑤待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到聚乙二烯39 重庆医科大学博士研究生学位论文硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点的被3%的小牛血清进行封闭，阻断并在4°C过夜，然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体或a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时，然后接种用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在室温下封闭1小时。最后，用化学免疫发光（ECL）检测系统（美国，乌普萨拉，瑞典）检测特异性结合。TNF-α和IL-1β水平用其与GAPDH相对灰度值表示。1.2.5统计学分析：全部数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理，结果用均数加减标准差表示，多组间比较采用方差分析。实验结果用双尾t检验进行分析，p值小于0.05认为组间差异具有统计学意义。2结果：2.12型糖尿病骨折患者前炎症细胞因子的上调为了研究2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律，本研究测量了2型糖尿病骨折、非骨折和骨折非糖尿病患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES含量的变化，并进行组间比较，在实验前患者的基线资料在性别、年龄体重指数、患病时间和空腹血糖水平均进行比较，三组间各项指标间差异均无统计学意义（表1)。血清hsCRP的水平，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者（图1，表2），同样，促炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6（图2，表3，图3，表4，图4表5）的水平也是2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，组间比较差异均有统计学意义，IP-10和RANTES的水平与以上因子规律相同，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，差异具有统计学意义，因此由以上结果说明，高糖可以促进骨折患者炎症相关因子升高。40 重庆医科大学博士研究生学位论文表1研究基线资料Table1CharacteristicsofT2DMpatientswithorwithoutfracture.特征Characteristics糖尿病+骨折糖尿病非糖尿病骨折PvalueT2DM+FractureT2DMcontrolFracture(T2DM-)(n=28)(n=22)(n=25)年龄Age(years)58.36±4.6559.50±4.7656.54±4.230.5648a/0.2671b性别Gender男Male181014女Female1012110.1830a/0.5381b体重指数BMI(kg/m2)29.68±0.9630.16±1.04/0.5430糖尿病患病年DM17.64±2.7518.24±3.12/0.6572duration(years)快速血糖Fasting145.6±11.5142.3±10.2/0.4170glucose(mg/dL)糖化血红蛋白8.5±0.58.9±0.7/0.6235HbA1c,%(mmol/mol)低密度脂蛋白LDL98.7±8.8105.7±10.3/0.3416(mg/dL)高密度脂蛋白HDL42.4±4.144.6±4.8/0.6235(mg/dL)a:T2DM+FracturevsT2DMcontrol;b:T2DM+FracturevsFracture(T2DM-);BMI:BodyMassIndex;DM:Diabetesmellitus;41 重庆医科大学博士研究生学位论文图1三组间血清hsCRP含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Figure1hsCRPinT2DMpatientswithbonefracture表2三组间血清hsCRP含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Table2hsCRPinT2DMpatientswithbonefractureT2DM+FractureT2DMcontrolFracture(T2DM-)均数标准差个数均数标准差个数均数标准差个数2.327280.630.21224.37.51.2626图2三组间血清IL-1β含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Figure2IL-1βinT2DMpatientswithbonefracture42 重庆医科大学博士研究生学位论文表3三组间血清IL-1β含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Table3IL-1βinT2DMpatientswithbonefractureT2DM+FractureT2DMcontrolFracture(T2DM-)均数标准差个数均数标准差个数均数标准差个数97.2624.582830.768.532268.4617.4925图3三组间血清TNF-α含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Figure3TNF-αinT2DMpatientswithbonefracture表4三组间血清TNF-α含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Table4TNF-αinT2DMpatientswithbonefractureT2DM+FractureT2DMcontrolFracture(T2DM-)均数标准差个数均数标准差个数均数标准差个数267.2958.532841.2914.6822144.5632.2225图4三组间血清IL-6含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Figure4IL-6inT2DMpatientswithbonefracture43 重庆医科大学博士研究生学位论文表5三组间血清IL-6含量比较，*:p<0.05,**:p<0.01,****:p<0.0001.Table5IL-6inT2DMpatientswithbonefractureT2DM+FractureT2DMcontrolFracture(T2DM-)均数标准差个数均数标准差个数均数标准差个数125.2428.622856.711.22288.2522.38252.2高糖诱导成骨细胞MG-63产生肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β生成规律的研究为了进一步研究2型糖尿病患者促进前炎症因子和趋化因子分泌增多的机制，我们进一步在mRNA和蛋白水平研究了高糖诱导成骨细胞TNF-α和IL-1β的水平变化，我们分别用5,10,20和40mM的葡萄糖与成骨细胞MG-63共培养12小时，利用RT-qPCR和ELISA的方法测量其相关指标。我们发现TNF-α的mRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，为（2.823±0.2751），其次为20mM葡萄糖组为（1.680±0.1589），不同浓度组间比较，差异具有统计学意义，TNF-α的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性（图5，表6）；IL-1βmRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，为（4.574±0.4457），其次为20mM葡萄糖组为（2.847±0.1775），不同浓度组间比较，差异具有统计学意义（图6表7）。TNF-α的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性，以上两类因子在蛋白水平（图7，表8，图9，表10）的表达规律与在mRNA水平一致，不同浓度组间比较差异均具有统计学意义。44 重庆医科大学博士研究生学位论文图55,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，TNF-α(A)mRNA水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.Figure5MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforthemRNAlevelsofTNF-α(A)，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.表65,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，TNF-α(A)mRNA水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.Table6MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforthemRNAlevelsofTNF-α(A)，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.测量次数5mM10mM20mM40mM1次1.021.051.672.782次1.151.211.412.373次0.860.951.963.3245 重庆医科大学博士研究生学位论文图65,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，IL-1BmRNA水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义Figure6MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforthemRNAlevelsofIL-1B，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.表75,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，IL-1BmRNA水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义Table7MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforthemRNAlevelsofIL-1B，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.5mM10mM20mM40mM1次1.021.0043.16924.50362次1.151.2122.81583.83943次0.861.1322.55685.378446 重庆医科大学博士研究生学位论文图75,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，TNF-α水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义.Figure7MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforlevelsofTNF-α，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.表85,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，TNF-α水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义.Table8MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforTNF-α(A)，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.次数5mM10mM20mM40mM1次87981482562次1051181332233次12313117228147 重庆医科大学博士研究生学位论文图85,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，IL-1B水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义.Figure8MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedforIL-1B，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.表95,10,20or40mM葡萄糖诱导85%浓度的成骨细胞MG-63，IL-1B水平比较，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:差异无统计学意义.Table9MG-63cellswith85%confluenceweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucosefor8hoursandthenquantifiedfortheIL-1B，*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,ns:nosignificance.5mM10mM20mM40mM1次54832313532次71972603153次8611220338548 重庆医科大学博士研究生学位论文3讨论骨折愈合是一个极其复杂的病理生理过程，即是正常胚胎骨发生的重演过程，是一系列细胞与细胞外的基质改变。骨折愈合相关机制受患者机体以及局部环境的多途径多层面调节，不同细胞参与骨折愈合的不同阶段，并且多种细胞因子表达水平发生改变，从而影响骨折愈合速度和效果。各类细胞因子和炎症因子是人体内重要信号传递分子，参与细胞分化、增殖、凋亡、基质代谢等多个方面的调控[10]。伴随骨折愈合研究的不断深入，人们逐渐认识到各类细胞因子和炎症因子在骨折愈合中的作用价值[11]。骨折愈合过程非常复杂，受细胞、分子、遗传等多种因素影响[12]。虽然，目前临床对各种各类细胞因子和炎症因子在骨折愈合过程中的作用机制进行一些较为深入的研究[13]，且部分各类细胞因子和炎症因子已经在临床中开展应用，但是各种各类细胞因子和炎症因子对成骨细胞、软骨细胞等的增殖、分化及其在骨折愈合不同阶段的对应作用机制，特别是各个各类细胞因子和炎症因子间的相互作用关系尚不清楚[14]，是今后临床研究中需要探索的重要问题。另外，对于如何在骨折愈合过程中恰当使用生长因子，各个生长因子间联合作用、剂量比例等问题需进行深入的研究予以补充，旨在为骨折患者可获得有效治疗和促进骨愈合提供安全、有效的治疗措施。糖尿病本身是一个多器官受高血糖影响的全身性疾病，高血糖不利于成骨细胞分化，导致骨质疏松容易诱发骨折，同时骨折后又由于高血糖导致骨折断端周围微血管功能较差，不能为骨折修复提供充足的营养，同样可以引起骨折不愈合[14]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路从而激活破骨细胞功能和促进骨吸收，而糖尿病促进破骨细胞分化抑制了糖尿病骨折病人的骨折愈合，因此，糖尿病患者骨折愈合较为缓慢甚至不愈合，临床处理比较棘手[15]。白细胞介素1β和白细胞介素6也会因为糖尿病的严重程度增高，有研究发现，白细胞介素1β可以通过肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6损伤胰腺β-细胞，同时TNF-α和IL-6可以促进糖尿病患者的胰岛素抵抗，加重糖尿病的病情[16-20]。因此本部分通过为测量了2型糖尿病骨折、非骨折和骨折非糖尿病患者血49 重庆医科大学博士研究生学位论文清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES含量的变化，并进行组间比较发现，血清hsCRP的水平，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，同样，促炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的水平也是2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，IP-10和RANTES的水平与以上因子规律相同，2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者，因此由以上结果说明，高糖可以促进骨折患者炎症相关因子升高。为了进一步研究2型糖尿病患者促进前炎症因子和趋化因子分泌增多的机制，我们进一步在mRNA和蛋白水平研究了高糖诱导成骨细胞TNF-α和IL-1β的水平变化，TNF-α的mRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，TNF-α的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性，IL-1βmRNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，IL-1β的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性，以上两类因子在蛋白水平的表达规律与在mRNA水平一致，不同浓度组间比较差异均具有统计学意义。4小结1.2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律为2型糖尿病骨折患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量大于2型糖尿病非骨折患者，前两者大于骨折非糖尿病患者。2.TNF-α和IL-1β在mRNA水平和蛋白水平，会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高，其中40mM葡萄糖组最高，其次为20mM葡萄糖组，不同浓度组间比较，差异具有统计学意义。TNF-α和IL-1β的mRNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性。参考文献[1]Zhang,W.,F.Zhang,H.Shi,etal.Comparisonsofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellisolationandculturemethodsinvitro.PLoSOne[J].2014.9(2):p.e88794.[2]Wu,X.,J.Cheng,P.Li,etal.Mechano-sensitivetranscriptionalfactorEgr-150 重庆医科大学博士研究生学位论文regulatesinsulin-likegrowthfactor-1receptorexpressionandcontributestoneointimaformationinveingrafts.ArteriosclerThrombVascBiol[J].2010.30(3):p.471-6.[3]Zhang,B.,C.Xian,Y.Luo,etal.Expressionandsubcellularlocalizationofmechano-growthfactorinosteoblastsundermechanicalstretch.SciChinaCLifeSci[J].2009.52(10):p.928-34.[4]Zhang,B.,P.Jiang,C.Xian,etal.[Expressionofmechano-growthfactorinEscherichiacoliandactivityanalysis].ShengWuGongChengXueBao[J].2008.24(7):p.1180-5.[5]Xin,J.,Y.Wang,Z.Wang,etal.Functionalandtranscriptomicanalysisoftheregulationofosteoblastsbymechano-growthfactorEpeptide.BiotechnolApplBiochem[J].2014.61(2):p.193-201.[6]Sun,W.,K.Zhang,G.Liu,etal.Sox9genetransferenhancedregenerativeeffectofbonemarrowmesenchymalstemcellsonthedegeneratedintervertebraldiscinarabbitmodel.PLoSOne[J].2014.9(4):p.e93570.[7]Oliveira,C.S.,C.E.deBock,T.J.Molloyetal.MacrophagemigrationinhibitoryfactorengagesPI3K/Aktsignallingandisaprognosticfactorinmetastaticmelanoma.BMCCancer[J].2014.14:p.630.[8]Mikami,S.,A.Nakashima,K.Nakagawa,etal.Autologousbone-marrowmesenchymalstemcellimplantationandendothelialfunctioninarabbitischemiclimbmodel.PLoSOne[J].2013.8(7):p.e67739.[9]Mavrommatis,E.,K.M.Shioura,T.Los,etal.TheE-domainregionofmechano-growthfactorinhibitscellularapoptosisandpreservescardiacfunctionduringmyocardialinfarction.MolCellBiochem[J].2013.381(1-2):p.69-83.[10]Zhu,J.,A.Yu,B.Qi,etal.Effectsofnegativepressurewoundtherapyonmesenchymalstemcellsproliferationandosteogenicdifferentiationinafibrinmatrix.PLoSOne[J].2014.9(9):p.e107339.[11]Zha,L.,J.Chen,S.Sun,etal.SoyasaponinsCanBluntInflammationbyInhibitingtheReactiveOxygenSpecies-MediatedActivationofPI3K/Akt/NF-kBPathway.51 重庆医科大学博士研究生学位论文PLoSOne[J].2014.9(9):p.e107655.[12]Zablocka,B.,P.H.Goldspink,G.Goldspink,etal.Mechano-GrowthFactor:animportantcogoraloosescrewintherepairmachinery?FrontEndocrinol(Lausanne)[J].2012.3:p.131.[13]You,W.,H.Gao,L.Fan,etal.Foxc2regulatesosteogenesisandangiogenesisofbonemarrowmesenchymalstemcells.BMCMusculoskeletDisord[J].2013.14:p.199.[14]Yanai,T.,T.Ishii,F.Chang,etal.Repairoflargefull-thicknessarticularcartilagedefectsintherabbit:theeffectsofjointdistractionandautologousbone-marrow-derivedmesenchymalcelltransplantation.JBoneJointSurgBr[J].2005.87(5):p.721-9.[15]Wei,Z.,N.Chen,H.Guo,etal.Bonemarrowmesenchymalstemcellsfromleukemiapatientsinhibitgrowthandapoptosisinserum-deprivedK562cells.JExpClinCancerRes[J].2009.28:p.141.[16]WangG,YangH,LiM,etal.Theuseofsilkfibroin/hydroxyapatitecompositeco-culturedwithrabbitbone-marrowstromalcellsinthehealingofasegmentalbonedefect.JBoneJointSurgBr[J].2010,92(2):320-325．[17]IvanCarcamo-Orive，AinhoaGaztelumendi，etal．ＲegulationofHumanBoneMarrowStromalCellProliferationandDifferentiationCapacitybyGlucocorticoidＲeceptorandAP-1Crosstalk.JBoneMinnerＲes.2010.25(10):2115-2125[18]黄思敏，王俊玲，魏秋实，等。糖皮质激素双向调节骨髓基质干细胞的分化机制。中国骨质疏松杂志。2014，20（11）：1379-1382[19]KagamiH,AgataH,TojoA.Bonemarrowstromalcells(bonemarrow-derivedmultipotentmesenchymalstromalcells)forbonetissueengineering:basicsciencetoclinicaltranslation[J].IntJBiochemCellBiol.2011.43(3):286-289[20]Orriss,I.R.,M.O.Hajjawi,C.Hues,etal.Optimisationofthedifferingconditionsrequiredforboneformationinvitrobyprimaryosteoblastsfrommiceandrats.IntJMolMed[J],2014.34(5):p.1201-8.[21]Manzano,R.G.,E.M.Martinez-Navarro,J.Fortez,etal.Microarrayphosphatome52 重庆医科大学博士研究生学位论文profilingofbreastcancerpatientsunveilsacomplexphosphataseregulatoryroleoftheMAPKandPI3Kpathwaysinestrogenreceptor-negativebreastcancers.IntJOncol[J],2014.[22]Kushwaha,P.,V.Khedgikar,J.Gautam,etal.AnoveltherapeuticapproachwithCaviunin-basedisoflavonoidthatenroutesbonemarrowcellstoboneformationviaBMP2/Wnt-beta-cateninsignaling.CellDeathDiffer[J],2014.5:p.e1422.53 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究通过本文第一部分研究结果我们发现2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律为2型糖尿病骨折患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量大于2型糖尿病非骨折患者；TNF-α和IL-1β在mRNA水平和蛋白水平，会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的增高而增高，TNF-α和IL-1β的mRNA和蛋白的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性。而有研究发现糖尿病可以促进核因子kapaB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路从而激活破骨细胞功能和促进骨吸收，而糖尿病促进破骨细胞分化抑制了糖尿病骨折病人的骨折愈合，因此，糖尿病患者骨折愈合较为缓慢甚至不愈合，临床处理比较棘手[1-5]。有研究发现，糖尿病骨折愈合中重要的机制是肿瘤坏死因子水平上调，而上调的肿瘤坏死因子参与诱发糖尿病患者神经、心血管、视网膜及炎症副反应，除了肿瘤坏死因子，白细胞介素1β和白细胞介素6也会因为糖尿病的严重程度增高[6-10]，有研究发现，白细胞介素1β可以通过肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6损伤胰腺β-细胞，同时TNF-α和IL-6可以促进糖尿病患者的胰岛素抵抗，加重糖尿病的病情[11-13]。肿瘤坏死因子被认为与骨吸收和炎症密切相关，大量的研究证实，肿瘤坏死因子诱导的金属基质蛋白-9不仅会影响破骨细胞分化和骨质破坏，而且可以作用于成骨细胞和骨祖细胞，影响其分化与转化[14-16]。肿瘤坏死因子-α可以促进骨折周围的炎症反应，也是参与炎症反应的主要介质，糖尿病小鼠模型中，高水平的肿瘤坏死因子-α可以加速骨折周围骨质丢失，在体外肿瘤坏死因子能促进成骨类细胞凋亡，但是其诱导成骨细胞凋亡的机制尚不清楚[17-19]。因此本文部分；通过检测在不同浓度葡萄糖干扰下肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞MG-63活性的影响的规律同时检测对成骨细胞凋亡和凋亡相关因子表达的影响，为研究2型糖尿病患者TNF-α在骨折愈合过程中的作用分子机制，及防治骨折不愈合奠基础。54 重庆医科大学博士研究生学位论文1材料1.1.1实验试剂人类成骨细胞MG-63中国医学科学院提供Dulbecco'sModifiedEagle'sMediumGibco,Rockville,MD,USA(EMEM)0%的胎牛血清GIBCO,Rockville,MD,USA聚丙烯酰胺凝胶金斯瑞生物技术有限公司二甲苯溶液北京百泰克生物技术有限公司聚偏二氟乙烯膜美国BD北京众益中和生物技术有限公司公司100mg/mL的链霉素哈尔滨制药有限公司NonEssentialAminoAcids(NEAA)ThermoScientific,Rockford,IL,USAGlutamineSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAPBS缓冲液北京万华生物技术有限公司CellLysisBufferCellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA150mMNaCl北京达科生物技术有限公司1%NP-40SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USASigma-AldrichSt.Louis,MO,USA亚硫酸氢钠金斯瑞生物技术有限公司D-glucoseSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)TNF-αSigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO,USA)引物SangonBiotechCompany(Shanghai,China)55 重庆医科大学博士研究生学位论文DMSOCellSignalingTechnologyInc.(Danvers,MA,USA培养板北京赛因坦科技有限公司enzyme-linkedimmunosorbentassayAbcam,Cambridge,UK(ELISA)kit1×Binding缓冲液上海信裕生物技术有限公司BovineSerumAlbuminSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA100mg/mL青霉素石家庄药业有限公司lipofectamine2000Invitrogen,Carlsbad,CA,USAskimmedmilkSolarbio,Beijing,ChinaTRIzolreagentInvitrogen,Carlsbad,CA,USARNasin®PlusRNaseInhibitorPromega,Madison,WI,USA蛋白抽提试剂盒ThermoFisherScientific,Waltham,MA,硝酸纤维素膜USARNaseinhibitor蛋白酶抑制剂Promega,Madison,WI,USABCAProteinAssayReagentKitAbcam,Cambridge,UKp65兔多克隆抗体Abcam,Cambridge,UKIκBAbcam,Cambridge,UKSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA内参β-actinSinobio,Pierce,Rockford,IL,USAAbcam,Cambridge,MA,USA辣根过氧化物酶羊抗兔抗体SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USAβ-actinSinobio,Beijing,ChinaproteaseinhibitorcocktailPierce,Rockford,IL,USABio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)Mitochondria/CytosolFractionationKitAbcam,Cambridge,UKECLkitAmershamPharmaciaBiotech,56 重庆医科大学博士研究生学位论文Amersham,UKMTTassay(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)1.1.2实验仪器移液器配套枪头北京北大维信生物科技有限公司全自动酶标北京北大维信生物科技有限公司DNA电泳槽北京北大维信生物科技有限公司高速离心机北京北大维信生物科技有限公司电热恒温水槽北京北大维信生物科技有限公司凝胶成像仪北京北大维信生物科技有限公司微量移液器恒温培养箱北京北大维信生物科技有限公司恒温摇床北京北大维信生物科技有限公司移液器配套枪头北京北大维信生物科技有限公司凝胶成像分析系统北京六一仪器厂水平电泳仪仪北京北大维信生物科技有限公司正置荧光显微镜奥林巴斯公司，东京细胞刮北京北大维信生物科技有限公司细胞培养瓶北京北大维信生物科技有限公司细胞培养板北京北大维信生物科技有限公司微量上样器北京北大维信生物科技有限公司盖玻片北京北大维信生物科技有限公司普通冰箱海尔公司滤纸北京北大维信生物科技有限公司离心管北京北大维信生物科技有限公司载玻片北京北大维信生物科技有限公司微量离心管北京北大维信生物科技有限公司制冰机海尔公司移液管艾本德中国上海有限公司稳压电泳仪MajorScience公司57 重庆医科大学博士研究生学位论文电子天平奥豪斯美国有限公司去离子水机上海和泰公司超低温冰箱艾本德中国上海有限公司超纯水系统诺克尔过滤(苏州)有限公司精密电子天平梅特勒-托利多公司超低温冰箱艾本德中国上海有限公司生物安全柜广州市深华生物技术有限公司冻存管艾本德中国上海有限公司1.2方法1.2.1成骨细胞培养与D-glucose和TNF-α干扰模型的造模人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham'sF12的基质和Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养液中培养，培养液中添加2.5mM左旋谷酰胺和0.3mg/mlG418(ThermoScientific,Rockford,IL,USA)，并且添加10%小牛血清hFOB1.19细胞在5%CO2，37°C环境下温箱中培养。高糖环境造模方法，将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α，以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。1.2.2检测不同浓度葡萄糖和肿瘤坏死因子—α干扰下细胞活力用MTT法检测人类成骨细胞MG-63细胞活力，以下简单描述MTT法，将85%细胞浓度的人类成骨细胞MG-63均与种植在96孔板上，分组并用5,10,20or40mMD-glucose,和5,10,20or40ng/mLTNF-α共培养24,48和72小时，然后在每个孔中加入10μLMTT试剂，37°C下孵育4小时，再每个孔加入100μLDMSO后，在波长570nm下，用ELISAplate仪测量各组的吸光度。1.2.3检测不同浓度葡萄糖和肿瘤坏死因子—α干扰下细胞凋亡水平用annexinV-FITCapoptosisdetection试剂盒检测MG-63细胞的凋亡，1×106的MG-63细胞，用annexinV-FITCandpropidiumiodide试剂盒进行染色，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平，其结果用凋亡细胞比全部细胞的比值表示。1.2.4免疫印迹法法检测成骨细胞凋蛋白cytochromec,cleavedcaspase3和lyzedPARP蛋白的含量58 重庆医科大学博士研究生学位论文参照细胞浆的蛋白用和细胞裂解液(CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白，并辅以一蛋白酶抑制剂。细胞总蛋白的提取药物作用不同时间后，弃去培养基，PBS液洗一次，将细胞粉碎后加入1ml的PBS中1000rpm，4℃离心5min。倾去上层液体，非变性蛋白裂解液裂解组织细胞，冰上静置25min，12000rpm，4℃，离心15min，收集上清可溶性蛋白组分，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。BCA法测定蛋白，用裂解液将蛋白调整至相同浓度，l：4比例加入5上样缓冲液后,97℃沸水浴5min，冷却后电泳上样。胞浆-核蛋白的提取用胞浆-胞核蛋白抽提试剂盒提取细胞核和细胞浆蛋白。处于对数生长期的细胞,以5×105/瓶接种到25cm2培养瓶中,培养24h,加入谷氨酰胺（时间效应关系研究中加谷氨酰胺4mM,分别于给药后0，6，12，24，48h收集细胞,检测cytochromec,cleavedcaspase3和lyzedPARP蛋白表达。吸出上清液,用预冷的PBS将细胞洗涤1次，800rmp,4℃离心5min,弃上清。估计离心后的细胞体积,加入5倍体积的胞浆裂解液。涡旋混合仪剧烈振荡30s,冰上放置15min,并每隔5min在涡旋混合仪上振荡15s,1000rmp,4℃离心5min。沉淀为核粗提物,上清则是胞浆蛋白。尽快将上清转入另一预冷的离心管中,12000rmp,4℃离心5min,得胞浆蛋白,一70℃保存。沉淀用100ulul胞浆裂解液洗涤一次,加入20ul核蛋白裂解液,最大转速涡旋剧烈振荡15s,冰上放置30min,每隔10min涡旋振荡15s,12000rmp,,4℃离心5min,上清即为所提核蛋白。考马斯亮蓝定蛋白,用裂解缓冲液调整蛋白浓度一致,-70℃。丙烯酰胺凝胶灌制①安装玻璃板。②将配置好的分离胶溶液迅速灌注于玻璃板的间隙中，留出浓缩胶所需空间，用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水。③分离胶聚合完全后（30分钟），倒出覆盖层液体，可用滤纸的边缘吸净残留液体。④在已聚合的分离胶上直接灌注已配置好的浓缩胶，长度是0.5-1cm，立即插入干净的梳子，避免混入气泡。30分钟左右聚合完成。蛋白电泳①将定量后的蛋白样品从-80℃取出，融化之后加入1/4体积的5×Loading59 重庆医科大学博士研究生学位论文Buffer，震荡混匀并离心。②将混匀的蛋白样品在沸水中煮5分钟，取出并离心备用。③把提前配置好的凝胶固定于电泳装置上，上、下槽中均加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。取出小梳子后，用注射器的针头冲洗加样槽，除去未聚合的丙烯酰胺。必须设法排出凝胶底部的气泡。④按预定顺序加样。每加完一个样品应在缓冲液中洗涤注射器，或更换枪尖。⑤正确连接电极。浓缩胶电压80V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到100-120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。⑥撬开玻璃板，取出凝胶，切下凝胶的一角做出方位标记。蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体①膜的选择：目的蛋白分子量150kDa，选用硝酸纤维素膜（NC膜）。②膜的预处理：在电泳结束前剪裁滤膜和滤纸，其大小应与凝胶完全吻合。把剪裁好的NC膜漂浮于一盘1×转移缓冲液的液面上，待其从下往上湿润后，将之浸没于其中，浸泡5分钟以上以祛除滤膜上的气体。滤纸同样浸泡于1×转移缓冲液中平衡。③制作膜胶夹心：小心除尽凝胶与膜，以及与滤纸之间的气泡。单侧滤纸是4层，即滤纸、膜、胶、滤纸。④在恒压65V下转移三小时。⑤待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点的被3%的小牛血清进行封闭，阻断并在4°C过夜，然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体或a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时，然后接种用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在室温下封闭1小时。最后，用化学免疫发光（ECL）检测系统检测特异性结合。cytochromec,cleavedcaspase3和lyzedPARP水平用其与GAPDH相对灰度值表示。1.2.5统计学分析：全部数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理，结果用均数加减标准差表示，多组间比较采用方差分析。实验结果用双尾t检验进行分析，p值小于0.05认为组间差异具有统计学意义。60 重庆医科大学博士研究生学位论文2结果2.1.肿瘤坏死因子-α和葡萄糖降低成骨细胞MG-63活力机制本部分我们设想肿瘤坏死因子-α和葡萄糖能够诱导成骨细胞MG-6活力，因此我们通过MTT实验检测在不同浓度的肿瘤坏死因子-α和葡萄糖干扰成骨细胞活力的变化，我们发现，用40mM的葡萄糖培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，同样，在20or40ng/mL的肿瘤坏死因子-α培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，不同浓度组间差异具有统计学意义。当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞时，10ng/mL肿瘤坏死因子-α可以显著性降低成骨细胞MG-6活力；当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞时，20和40ng/mL肿瘤坏死因子-α成骨细胞MG-6的活力水平比0和10ng/m低，组间比较差异具有统计学意义，细胞活力与肿瘤坏死因子-α呈计量依赖性（图1，2表1,2）；为了进一步研究葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对成骨细胞活力影响的交互作用，我们将5mMD-glucose培养组设置为对照组，单纯20mMD-glucose培养组,单纯20ng/mLTNF-α培养组和既有20mMD-glucose又有20ng/mLTNF-α混合组间成骨细胞活力进行比较，我们发现，单纯20mMD-glucose组和单纯20ng/mLTNF-α组间成骨细胞活力变化差异无统计学意义，既有20mMD-glucose又有20ng/mLTNF-α混合组间成骨细胞活力在细胞培养48和72后显著性下降，差异具有统计学意义。（图3，表3,4）61 重庆医科大学博士研究生学位论文图1用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用5,10,20or40mM葡萄糖和5,10,20or40ng/mLTNF-α培养24小时，所有结果都是重复测量三次，p˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,ns差异无统计学意义Figure1CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α.RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucoseor(and)5,10,20or40ng/mLTNF-αfor24hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.Andeachstatisticalsignificancewasconsideredwhenp˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,nsnosignificance.表1用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用5,10,20or40mM葡萄糖和5,10,20or40ng/mLTNF-α培养24小时，所有结果都是重复测量三次，Table1CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α.RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucoseor(and)5,10,20or40ng/mLTNF-αfor24hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.AndeachstatisticalsignificancewasconsideredDG均数标准差个数TGF-a均数标准差个数(mM)(ng/mL)51007.65351008.2531094.256.8431090.336.332086.345.9132081.275.6534077.25.3234070.65.02362 重庆医科大学博士研究生学位论文图2用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用5,10,20or40mM葡萄糖和5,10,20or40ng/mLTNF-α培养24小时，所有结果都是重复测量三次，p˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,ns差异无统计学意义Figure2CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α.RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucoseor(and)5,10,20or40ng/mLTNF-αfor24hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.Andeachstatisticalsignificancewasconsideredwhenp˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,nsnosignificance.表2用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用5,10,20or40mM葡萄糖和5,10,20or40ng/mLTNF-α培养24小时，所有结果都是重复测量三次。Table2CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α.RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith5,10,20or40mMD-glucoseor(and)5,10,20or40ng/mLTNF-αfor24hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.AndeachstatisticalsignificancewasconsideredDG(mM)TNF-a均数标准差次数(ng/mL)501007.65320090.25.323201070.344.423202046.22.613204023.251.84363 重庆医科大学博士研究生学位论文图3用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用20mM葡萄糖和20ng/mLTNF-α培养24，48,72小时，所有结果都是重复测量三次，p˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,ns差异无统计学意义Figure3CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α，.Time-dependenceoftheviabilityreductioncausedbythetreatmentwith20mMD-glucoseor(and)20ng/mLTNF-αinMG-63cells，RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith20mMD-glucoseor(and)20ng/mLTNF-αfor24，48,72hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.Andeachstatisticalsignificancewasconsideredwhenp˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,nsnosignificance.表3用不同浓度的葡萄糖和肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞活性，分别用20mM葡萄糖和20ng/mLTNF-α培养24，48,72小时，所有结果都是重复测量三次，p˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,ns差异无统计学意义Table3CellularviabilityreductionofMG-63cellsinducedbythetreatmentwithD-glucoseor(and)TNF-α，.Time-dependenceoftheviabilityreductioncausedbythetreatmentwith20mMD-glucoseor(and)20ng/mLTNF-αinMG-63cells，RelativeviabilityofMG-63cellswith85%confluence,whichweretreatedwith20mMD-glucoseor(and)20ng/mLTNF-αfor24，48,72hours;Allresultswereavereagedfortripleindependentassays.Andeachstatisticalsignificancewasconsideredwhenp˂0.05orless.*p˂0.05,**p˂0.01,or***p˂0.001,nsnosignificance.时间ControlDG(20mM)TNF-DG+TNF-ng/mL)010001000100010002496.256.5394.256.5383.345.4173.23.824890.646.1686.645.6672.174.5556.423.567282.635.1477.635.1457.964.1242.933.0464 重庆医科大学博士研究生学位论文表4分别用20mM葡萄糖和20ng/mL诱导成骨细胞活性，Statisticalanalysisofthecellularviabilityreductionbythetreatmentwith20mMD-glucoseor(and)20ng/mLTNF-αinMG-63cells.2.肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导成骨细胞MG-63凋亡及相关凋亡蛋白的研究为了进一步研究肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导的成骨细胞凋亡机制，我们将实验分为三组，分别为单纯肿瘤坏死因子-α组，单纯葡萄糖组，和肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组。单纯葡萄糖组中，20mMD-glucos与5mMD-glucose诱导成骨细胞凋亡差异无统计学意义，然而在20mMD-glucos中再加入20ng/mLTNF-α并培养24小时和48小时后，会使成骨细胞凋亡显著性上调，差异具有统计学意义。（图4，表5）肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率均大于与其他组，其组间差异均具有统计学意义；同时我们又利用免疫印迹的方法检测了各组间细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量的变化，单纯20mM葡萄糖培养成骨细胞不会影响其凋亡蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量的变化，如果将20mM葡萄糖再加入20ng/mLTNF-α培养成骨细胞，可以显著性的促进成骨细胞分泌细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白，组间比较差异具有统计学意义。（图5，表6，图7,8）65 重庆医科大学博士研究生学位论文图4流式细胞仪检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞凋亡比率as*p<0.05,**p<0.01,or***p<0.001.Figure4FlowcytometricanalysisofD-glucose-or(and)TNF-α-inducedapoptosisinMG-63cellsResultswereaveragedfortripleindependentresults,as*p<0.05,**p<0.01,or***p<0.001.表5流式细胞仪检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞凋亡比率as*p<0.05,**p<0.01,or***p<0.001.Table5FlowcytometricanalysisofD-glucose-or(and)TNF-α-inducedapoptosisinMG-63cellsResultswereaveragedfortripleindependentresults,Statisticalsignificancewasshownas*p<0.05,**p<0.01,or***p<0.001.D-glucose(20mM)TNF-αDG+TNF-α小时均数标准差均数标准差均数标准差4.20.576.80.829.51.23245.70.9811.71.617.62.14866 重庆医科大学博士研究生学位论文图5检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP的而含量Figure5Westernblotanalysis(withaloadingamountof30μgforeachsample)ofapoptosis-associatedmarkersinMG-63cells,postthetreatmentwithD-glucose-or(and)TNF-αfor24hours;B:Relativelevelofreleasedcytochromec(Cytc)intheD-glucose-or(and)TNF-α-treatedMG-63cells,withβ-actinasinternalcontrol;图6检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞白细胞色素c的含量Figure6Westernblotanalysis(withaloadingamountof30μgforeachsample)ofapoptosis-associatedmarkersinMG-63cells,postthetreatmentwithD-glucose-or(and)TNF-αfor24hours;B:Relativelevelofreleasedcytochromec(Cytc)intheD-glucose-or(and)TNF-α-treatedMG-63cells,withβ-actinasinternalcontrol;TNF-a(20ng/mL)--++DG(20mM)-+-+0.1106670.1033330.4581.01440.1360.1440.390.85040.1586670.160.5231.165267 重庆医科大学博士研究生学位论文图7检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞cleavedcaspase3蛋白的含量Figure7Westernblotanalysis(withaloadingamountof30μgforeachsample)ofapoptosis-associatedmarkersinMG-63cells,postthetreatmentwithD-glucose-or(and)TNF-αfor24hours;cleavedcaspase3intheD-glucose-or(and)TNF-α-treatedMG-63cells,withβ-actinasinternalcontrolTNF-a(20ng/mL)--++DG(20mM)-+-+0.0553340.0516670.1526670.3381330.0680.0720.130.2834670.0793340.080.1743330.3884图8检测20mMD-glucoseor和20ng/mLTNF-α培养r24or48小时细胞lyzedpolyADP-ribosepolymerase(PARP)蛋白的含量68 重庆医科大学博士研究生学位论文Figure8Westernblotanalysis(withaloadingamountof30μgforeachsample)ofapoptosis-associatedmarkersinMG-63cells,postthetreatmentwithD-glucose-or(and)TNF-αfor24hours;lyzedpolyADP-ribosepolymerase(PARP)intheD-glucose-or(and)TNF-α-treatedMG-63cells,withβ-actinasinternalcontrol;TNF-a(20ng/mL)--++DG(20mM)-+-+0.055330.051670.198460.2817870.0680.0720.1690.236220.079330.080.226630.3236733讨论骨折为一种临床常见疾病，且骨折愈合的过程为一项复杂而耗时较长机体组织修复性过程，加之于骨折愈合过程中易出现不愈合或者延期愈合现象，临床需积极采取有效治疗措施，改善患者预后[20]。骨折愈合治疗方案历经生物物理学、数字信息学、细胞生物学及分子生物学等多项领域，研究成果显著，且伴随分子生物学和基因技术不断发展，借助基因科技将相关目的基因经载体向靶细胞导入方式能够通过特定生长因子蛋白加速骨折愈合，成为临床研究热点课题[21]。此外，基因治疗对骨折愈合的促进作用得到国内外多数实验证实，成为治疗骨折愈合有效方法，但基因治疗过程中亦会引起一定副作用[22]。骨缺损、骨折修复借助基因治疗于临床已研究多年，且治疗效果显著，但仍存在许多亟待解决的问题，需合理应用[23]。骨折愈合为一项阶段性病理性过程，在此过程中多种GF会以不同形式产生作用，主要有血管内皮促生长因子、成纤维细胞促生长因子、胰岛素样因子、骨转化促生长因子-β，骨形态发生蛋白对于骨折愈合至关重要，临床需加以重视[24]。采取基因方式医治骨折愈合过程中，会因某促骨形成蛋白表达时间延长等引起副反应发生，临床可根据病理、生理变化，按照具体需要对基因进行调节表达[25]，且加强对非毒性载体研究和潜在免疫类反应系统评估，以增加骨折愈合基因治疗安全性与有效性，改善患者预后，促进肢体功能恢复，提高生活质量。细胞的凋亡为细胞在基因调控下的程序性死亡，而肿瘤的的发生一般认为是细胞凋亡失衡，即促进细胞凋亡的基因减少，抑制凋亡的基因增量表达[26]，Caspase69 重庆医科大学博士研究生学位论文是半胱氨酸蛋白酶家族，其对细胞凋亡起到执行作用，其中Caspase-9结构较长，起到连接凋亡蛋白酶和衔接蛋白的作用[27]。Caspase-9结构中的CARD结构可以使前者绑定与APAF-1的该区域上，当后者发生结构变化时，暴露CARD结构，加速凋亡蛋白复合体的形成[28]。肿瘤坏死因子被认为与骨吸收和炎症密切相关，大量的研究证实，肿瘤坏死因子诱导的金属基质蛋白-9不仅会影响破骨细胞分化和骨质破坏，而且可以作用于成骨细胞和骨祖细胞，影响其分化与转化。肿瘤坏死因子-α可以促进骨折周围的炎症反应，也是参与炎症反应的主要介质[29]，糖尿病小鼠模型中，高水平的肿瘤坏死因子-α可以加速骨折周围骨质丢失，在体外肿瘤坏死因子能促进成骨类细胞凋亡[30-34]。第二部分我们通过MTT实验检测在不同浓度的肿瘤坏死因子-α和葡萄糖干扰小，细胞活力的变化，我们发现，用40mM的葡萄糖培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，同样，在20or40ng/mL的肿瘤坏死因子-α培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降，当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞时，10ng/mL肿瘤坏死因子-α可以显著性降低成骨细胞MG-6活力，当用20mM的葡萄糖培养成骨细胞时，20和40ng/mL肿瘤坏死因子-α成骨细胞MG-6的活力水平比0和10ng/m低，细胞活力与肿瘤坏死因子-α呈计量依赖性，单纯20mMD-glucose组和单纯20ng/mLTNF-α组间成骨细胞活力变化差异无统计学意义，既有20mMD-glucose又有20ng/mLTNF-α混合组间成骨细胞活力在细胞培养48和72后显著性下降。综上所述，肿瘤坏死因子-α可以显著性的降低2型糖尿病成骨细胞活力，促进凋亡，因此可以推断，2型糖尿病患者骨折不愈合或愈合缓慢主要与肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞凋亡，降低成骨细胞活性相关，因此，对于2型糖尿病患者骨折不愈合药物干预可以针对肿瘤坏死因子-α作为药物作用靶点进行干预。4小结1.葡萄糖和肿瘤坏死因子-α与成骨细胞MG-6的活力呈计量依赖性2.D-glucose复合TNF-α干扰成骨细胞48和72后，活力显著性下降。3.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率显著大于与单纯干扰组。70 重庆医科大学博士研究生学位论文4.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleavedcaspase3蛋白和lyzedPARP蛋白含量显著大于与单纯干扰组。参考文献[1]GerstenfeldLC,CullinaneDM,BarnesGL,GravesDT,EinhornTA.Fracturehealingasapost-nataldevelopmentalprocess:molecular,spatial,andtemporalaspectsofitsregulation.JCellBiochem2003;88:873-84.[2]VestergaardP,RejnmarkL,MosekildeL.Diabetesanditscomplicationsandtheirrelationshipwithriskoffracturesintype1and2diabetes.CalcifTissueInt2009;84:45-55.[3]PetitMA,PaudelML,TaylorBC,HughesJM,StrotmeyerES,SchwartzAV,CauleyJA,ZmudaJM,HoffmanAR,EnsrudKE.Bonemassandstrengthinoldermenwithtype2diabetes:theOsteoporoticFracturesinMenStudy.JBoneMinerRes2010;25:285-91.[4]HofbauerLC,BrueckCC,SinghSK,DobnigH.Osteoporosisinpatientswithdiabetesmellitus.JBoneMinerRes2007;22:1317-28.[5]PatschJM,BurghardtAJ,YapSP,BaumT,SchwartzAV,JosephGB,LinkTM.Increasedcorticalporosityintype2diabeticpostmenopausalwomenwithfragilityfractures.JBoneMinerRes2013;28:313-24.[6]LiuZ,AronsonJ,WahlEC,LiuL,PerrienDS,KernPA,FowlkesJL,ThrailkillKM,BunnRC,CockrellGE,SkinnerRA,LumpkinCJ.Anovelratmodelforthestudyofdeficitsinboneformationintype-2diabetes.ActaOrthop2007;78:46-55.[7]ReinwaldS,PetersonRG,AllenMR,BurrDB.Skeletalchangesassociatedwiththeonsetoftype2diabetesintheZDFandZDSDrodentmodels.AmJPhysiolEndocrinolMetab2009;296:E765-74.[8]HamannC,GoettschC,MettelsiefenJ,HenkenjohannV,RaunerM,HempelU,BernhardtR,Fratzl-ZelmanN,RoschgerP,RammeltS,GuntherKP,HofbauerLC.Delayedboneregenerationandlowbonemassinaratmodelofinsulin-resistant71 重庆医科大学博士研究生学位论文type2diabetesmellitusisduetoimpairedosteoblastfunction.AmJPhysiolEndocrinolMetab2011;301:E1220-8.[9]HamannC,RaunerM,HohnaY,BernhardtR,MettelsiefenJ,GoettschC,GuntherKP,StolinaM,HanCY,AsuncionFJ,OminskyMS,HofbauerLC.Sclerostinantibodytreatmentimprovesbonemass,bonestrength,andbonedefectregenerationinratswithtype2diabetesmellitus.JBoneMinerRes2013;28:627-38.[10]DobnigH,Piswanger-SolknerJC,RothM,Obermayer-PietschB,TiranA,StreleA,MaierE,MaritschneggP,SiebererC,Fahrleitner-PammerA.Type2diabetesmellitusinnursinghomepatients:effectsonboneturnover,bonemass,andfracturerisk.JClinEndocrinolMetab2006;91:3355-63.[11]NeerRM,ArnaudCD,ZanchettaJR,PrinceR,GaichGA,ReginsterJY,HodsmanAB,EriksenEF,Ish-ShalomS,GenantHK,WangO,MitlakBH.Effectofparathyroidhormone(1-34)onfracturesandbonemineraldensityinpostmenopausalwomenwithosteoporosis.NEnglJMed2001;344:1434-41.[12]BuieHR,CampbellGM,KlinckRJ,MacNeilJA,BoydSK.Automaticsegmentationofcorticalandtrabecularcompartmentsbasedonadualthresholdtechniqueforinvivomicro-CTboneanalysis.Bone2007;41:505-15.[13]LeeNK,SowaH,HinoiE,FerronM,AhnJD,ConfavreuxC,DacquinR,MeePJ,McKeeMD,JungDY,ZhangZ,KimJK,Mauvais-JarvisF,DucyP,KarsentyG.Endocrineregulationofenergymetabolismbytheskeleton.Cell2007;130:456-69.[14]RosaBV,BlairHT,VickersMH,KnightCG,MorelPC,FirthEC.SerumconcentrationsoffullyandundercarboxylatedosteocalcindonotvarybetweenestrouscyclestagesinSprague-Dawleyrats.Endocrine2013;44:809-11.[15]MorishimaY,KamisatoC,HondaY,FurugohriT,ShibanoT.Theeffectsofwarfarinandedoxaban,anoraldirectfactorXainhibitor,ongammacarboxylated(Gla-osteocalcin)andundercarboxylatedosteocalcin(uc-osteocalcin)inrats.ThrombRes2013;131:59-63.[16]HaffaA,KruegerD,BrunerJ,EngelkeJ,GundbergC,AkhterM,BinkleyN.Diet-72 重庆医科大学博士研究生学位论文orwarfarin-inducedvitaminKinsufficiencyelevatescirculatingundercarboxylatedosteocalcinwithoutalteringskeletalstatusingrowingfemalerats.JBoneMinerRes2000;15:872-8.[17]DonathMY,ShoelsonSE.Type2diabetesasaninflammatorydisease.NatRevImmunol2011;11:98-107.[18]BanerjeeM,SaxenaM.Interleukin-1(IL-1)familyofcytokines:roleintype2diabetes.ClinChimActa2012;413:1163-70.[19]CnopM,WelshN,JonasJC,JornsA,LenzenS,EizirikDL.Mechanismsofpancreaticbeta-celldeathintype1andtype2diabetes:manydifferences,fewsimilarities.Diabetes2005;54Suppl2:S97-107.[20]MlinarB,MarcJ,JanezA,PfeiferM.Molecularmechanismsofinsulinresistanceandassociateddiseases.ClinChimActa2007;375:20-35.[21]RedlichK,HayerS,RicciR,DavidJP,Tohidast-AkradM,KolliasG,SteinerG,SmolenJS,WagnerEF,SchettG.OsteoclastsareessentialforTNF-alpha-mediatedjointdestruction.JClinInvest2002;110:1419-27.[22]BenDD,ReznickAZ,SroujiS,LivneE.Exposuretopro-inflammatorycytokinesupregulatesMMP-9synthesisbymesenchymalstemcells-derivedosteoprogenitors.HistochemCellBiol2008;129:589-97.[23]KanekoM,TomitaT,NakaseT,OhsawaY,SekiH,TakeuchiE,TakanoH,ShiK,TakahiK,KominamiE,UchiyamaY,YoshikawaH,OchiT.Expressionofproteinasesandinflammatorycytokinesinsubchondralboneregionsinthedestructivejointofrheumatoidarthritis.Rheumatology(Oxford)2001;40:247-55.[24]RomasE,GillespieMT,MartinTJ.InvolvementofreceptoractivatorofNFkappaBligandandtumornecrosisfactor-alphainbonedestructioninrheumatoidarthritis.Bone2002;30:340-6.[25]AlblowiJ,KayalRA,SiqueiraM,McKenzieE,KrothapalliN,McLeanJ,ConnJ,NikolajczykB,EinhornTA,GerstenfeldL,GravesDT.Highlevelsoftumornecrosisfactor-alphacontributetoacceleratedlossofcartilageindiabeticfracturehealing.AmJPathol2009;175:1574-85.73 重庆医科大学博士研究生学位论文[26]PascherE,PerniokA,BeckerA,FeldkampJ.Effectof1alpha,25(OH)2-vitaminD3onTNFalpha-mediatedapoptosisofhumanprimaryosteoblast-likecellsinvitro.HormMetabRes1999;31:653-6.[27]SchmittgenTD,LivakKJ.Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeC(T)method.NatProtoc2008;3:1101-8.[28]MoriG,BrunettiG,ColucciS,OrangerA,CiccolellaF,SardoneF,PignataroP,MoriC,KarapanouV,BalliniA,MastrangeloF,TeteS,GrassiFR,GranoM.Osteoblastapoptosisinperiodontaldisease:roleofTNF-relatedapoptosis-inducingligand.IntJImmunopatholPharmacol2009;22:95-103.[29]Saidenberg-Kermanac'HN,CorradoA,LemeiterD,DeVernejoulMC,BoissierMC,Cohen-SolalME.TNF-alphaantibodiesandosteoprotegerindecreasesystemicbonelossassociatedwithinflammationthroughdistinctmechanismsincollagen-inducedarthritis.Bone2004;35:1200-7.[30]LiuR,BalHS,DestaT,BehlY,GravesDT.Tumornecrosisfactor-alphamediatesdiabetes-enhancedapoptosisofmatrix-producingcellsandimpairsdiabetichealing.AmJPathol2006;168:757-64.[31]TaylorPC.Anti-TNFtherapyforrheumatoidarthritisandotherinflammatorydiseases.MolBiotechnol2001;19:153-68.[32]BuR,BorysenkoCW,LiY,CaoL,SabokbarA,BlairHC.ExpressionandfunctionofTNF-familyproteinsandreceptorsinhumanosteoblasts.Bone2003;33:760-70.[33]EhnertS,FreudeT,IhleC,MayerL,BraunB,GraeserJ,FleschI,StockleU,NusslerAK,PschererS.Factorscirculatinginthebloodoftype2diabetesmellituspatientsaffectosteoblastmaturation-descriptionofanovelinvitromodel.ExpCellRes2015;332:247-58.[34]BrownML,YukataK,FarnsworthCW,ChenDG,AwadH,HiltonMJ,O'KeefeRJ,XingL,MooneyRA,ZuscikMJ.DelayedfracturehealingandincreasedcallusadiposityinaC57BL/6Jmurinemodelofobesity-associatedtype2diabetesmellitus.PLoSOne2014;9:e99656.74 重庆医科大学博士研究生学位论文综述一影响骨折愈合的因素研究进展【摘要】本文通过全面细致的分析骨折愈合的过程，感染影响骨折愈合的机制，缺氧影响骨折愈合的机制和糖尿病影响骨折愈合的机制等四个方面，总结了影响骨折愈合是个多因素作用下完成的，其任何一个环节收到影响后，均可以导致骨不愈合，影响骨折患者的治疗效果，本文通过分析骨折不愈合的原因，对于指导临床避免产生骨不连或骨折不愈合等现象的发生，降低患者的痛苦和经济负担具有重要的意义和价值。关键词：骨折；愈合；不愈合；骨折愈合是一个极其复杂的病理生理过程，即是正常胚胎骨发生的重演过程，是一系列细胞与细胞外的基质改变。骨折愈合相关机制受患者机体以及局部环境的多途径多层面调节，不同细胞参与骨折愈合的不同阶段，并且多种生长因子表达水平发生改变，从而影响骨折愈合速度和效果。生长因子是人体内重要信号传递分子，参与细胞分化、增殖、凋亡、基质代谢等多个方面的调控[1,2]。伴随骨折愈合研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子在骨折愈合中的作用价值；本研究主要将近年来参与骨折愈合过程的相因子的临床相关资料作综述，以为相关实践研究提供借鉴价值。1.骨折愈合的过程骨折的愈合的过程简单讲可以总结为淤去，新生和骨化。骨折最早为血肿机化其，也称为肉芽组织修复其，接着为原始骨痂形成期，其中骨痂形成的方式主要有软骨内骨化和膜内骨化两种方式，骨痂的种类有外骨痂，内骨痂和桥梁骨痂，骨折愈合最后为骨痂的改造期也叫塑性期[3-6]。2．感染影响骨折的愈合骨折愈合受多个因素的影响，其中骨折断端血液供应最为重要，如果骨折一个断端发生血液供应障碍，愈合就会缓慢，两端同时发生血供障碍，若不及时复位妥善固定，可能发生不愈合，断端之一发生完全丧失工学，易发生骨坏死[7-10]。75 重庆医科大学博士研究生学位论文骨骼的破坏不仅局限于损伤，同时也伴随感染，断端骨质的吸收，不但是由于损伤性充血，同时也是由于感染导致的充血，只有感染痊愈，充血小时，骨化才能开始，感染性骨折有创口存在，固定不牢，容易产生断端移位[11-14]。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是细菌内毒素的主要成分，包括特异性多糖，非特异性多糖和类脂A,其中类脂A是主要的毒性部分，而细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有结构，其也是细菌主要的致热源，有相关研究[15-17]表明，细菌释放的脂多糖是导致骨折不愈合的主要原因，脂多炎症过程如何引起局部的炎症反应，其反应通过何通路影响成骨细胞形成骨质的具体作用机制尚不清楚，国内外缺乏相关的研究，而该问题对于临床治疗骨折不愈合或者延迟愈合其意义重大[18-19]。炎症反应是机体对于外界的侵害和损伤的一种正常的防御，其有益于正常的骨折愈合过程，但是骨折后大量炎症因子的释放就会导致成骨细胞不能成骨或者破骨细胞活化[20-22]，有研究报道，炎症导致的骨折不愈合，主要是由于细菌脂多糖引起的成骨细胞炎症反应，例如白细胞介素-1，白细胞介素-6和活化因子配基（RANKL），或者是诱导成骨细胞分泌破骨细胞激活因子，从而能诱导破骨细胞成熟和激活。但是对于细菌脂多糖如何介导成骨细胞内信号传导的机制尚不清楚[23-25]。Toll样受体（Toll-LIKERECEPTOR,TLR）是参与非特异性免疫的一类重要的蛋白分子，Toll样受体是机体天然的监控器，可以监视各种不同的疾病分子模式，是机体抵抗感染的首要通道。Toll样受体可以识别细菌脂多糖，从而诱导分泌促炎细胞因子[26]。Toll样受体识别细菌脂多糖发挥炎症作用主要是通过Toll样受体信号传导的MyD88依赖机制，其主要过程是，配体结合Toll受体后导致MyD88聚集在Toll受体的TIR结构域，聚集后MyD88与IRAK相互作用，使其磷酸化，磷酸化后的IRAK与肿瘤坏死因子受体相关因子结合，最后介导炎症反应。也就是说细菌脂多糖通过骨髓分化因子88生成的炎症因子发挥着抑制成骨细胞成骨过程，但其具体机制如何尚不清楚[27]。骨折发生后，在各种炎症因子和其他细胞因子的作用下，骨折附近骨髓的间充质肝细胞分化发育成成骨细胞，其转化和分化的过程调节非常精密复杂，其作用机制如何，近年来有相关报道，有学者发现，闭合性骨折断端runt相关的转录76 重庆医科大学博士研究生学位论文因子-2及骨钙蛋白的水平增高，也有研究发现，如果实验动物敲除了runt相关的转录因子-2，其成骨细胞水平降低，骨折愈合困难，因此我们可以初步认为runt相关的转录因子-2作为启动骨髓间充质肝细胞的钥匙，有研究发现，runt相关的转录因子-2信号通路的激活与BMP受体激活导致的细胞内磷酸化相关，而前者正是形成骨钙蛋白刺激成骨的关键因素[28]。3．缺氧影响骨折的愈合骨折断端血供差和低氧是影响骨折愈合的主要原因，其主要机制使低氧和缺血导致局部成骨细胞、骨髓间充质干细胞的正常代谢，从而影响骨折愈合。特别是在低氧环境下，骨折断端组织释放或者表达例如低氧诱导因子(HIFs)、血管内皮生长因子和骨形态基因蛋白-2之类的转录因子和炎症因子，而以上因子在创伤愈合和骨折修复中发挥着重要的作用。骨形态发生蛋白尤其是骨形态发生蛋白-2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白可以在一定程度上缓解低氧对于骨间充质干细胞修复骨折的影响，但是长期的缺氧将会导致成骨细胞和骨间充质干细胞的凋亡甚至坏死[29]。通常状态下，骨折断端周围血管的损伤或者是新生骨痂周围新生血管生长抑制，均会导致断端缺氧，周围缺氧会导致缺氧诱导因子、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白等分泌增多，其中前者是抑制成骨细胞骨化和骨折愈合的重要因子，而后者是促进骨折愈合的因子。有研究通过骨折固定术后周围组织注射血管内皮生长因子可以提高骨折愈合的比率，但由于血管内皮细胞因子价格昂贵，或者还需要其他疗法的参与，因此难以在临床实施[30]。4.糖尿病糖尿病本身是一个多器官受高血糖影响的全身性疾病，高血糖不利于成骨细胞分化，导致骨质疏松容易诱发骨折，同时骨折后又由于高血糖导致骨折断端周围微血管功能较差，不能为骨折修复提供充足的营养，同样可以引起骨折不愈合。因此临床糖尿病患者骨折后由于血糖控制不理想导致的骨不连、假关节的形成和延迟愈合较为多见。因此如果能从分子机制上研究糖尿病骨折不愈合的因素对于提高糖尿病患者骨折治疗的疗效具有重要的意义和价值[31]。有研究发现糖尿病可以促进核因子kapaB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路从而激活破骨细胞功能和促进骨吸收，而糖尿病促进破骨细胞分化抑制了糖尿病骨折病人的骨折愈合，因此，糖尿病患者骨折愈合较为缓慢甚至不愈合，77 重庆医科大学博士研究生学位论文临床处理比较棘手。有研究发现，糖尿病骨折愈合中重要的机制是肿瘤坏死因子水平上调，而上调的肿瘤坏死因子与诱发糖尿病患者神经、心血管、视网膜及炎症副反应，除了肿瘤坏死因子，白细胞介素1β和白细胞介素6也会因为糖尿病的严重程度增高，有研究发现，白细胞介素1β可以通过肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6损伤胰腺β-细胞，同时TNF-α和IL-6可以促进糖尿病患者的胰岛素抵抗，加重糖尿病的病情[32-33]。肿瘤坏死因子被认为与骨吸收和炎症密切相关，大量的研究证实，肿瘤坏死因子诱导的金属基质蛋白-9不仅会影响破骨细胞分化和骨质破坏，而且可以作用于成骨细胞和骨祖细胞，影响其分化与转化。肿瘤坏死因子-α可以促进骨折周围的炎症反应，也是参与炎症反应的主要介质，糖尿病小鼠模型中，高水平的肿瘤坏死因子-α可以加速骨折周围骨质丢失，在体外肿瘤坏死因子能促进成骨类细胞凋亡，但是其诱导成骨细胞凋亡的机制尚不清楚[34-36]。5总结本文主要总结了影响骨折愈合的三个个重要因素，感染、缺氧和高血糖，当然影响骨折愈合的因素还其他，包括遗传、营养、全身和局部的骨质病变，外固定的方式等，因此，防止骨折不愈合的治疗过程复杂，还需要更进一步对相关分子机制进行研究，以达到综合预防的目的。References[1]CoutuDL,FrancoisM,GalipeauJ.InhibitionofcellularsenescencebydevelopmentallyregulatedFGFreceptorsinmesenchymalstemcells.Blood.2011.117(25):6801-12.[2]FriedensteinAJ.Precursorcellsofmechanocytes.IntRevCytol.1976.47:327-59.[3]PenaJR,PinneyJR,AyalaP,DesaiTA,GoldspinkPH.Localizeddeliveryofmechano-growthfactorE-domainpeptideviapolymericmicrostructuresimprovescardiacfunctionfollowingmyocardialinfarction.Biomaterials.2015.46:26-34.[4]PeuraM,BizikJ,SalmenperaP,etal.Bonemarrowmesenchymalstemcellsundergonemosisandinducekeratinocytewoundhealingutilizingthe78 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重庆医科大学博士研究生学位论文[14]LoFD,GrazianoAC,CaggiaS,etal.Decreaseofapoptosismarkersduringadipogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsfromhumanadiposetissue.Apoptosis.2013.18(5):578-88.[15]ZhangY,LvJ,GuoH,WeiX,LiW,XuZ.Hypoxia-inducedproliferationinmesenchymalstemcellsandangiotensinII-mediatedPI3K/AKTpathway.CellBiochemFunct.2015.33(2):51-8.[16]SaidakZ,LeHC,AzziS,etal.Wnt/beta-CateninSignalingMediatesOsteoblastDifferentiationTriggeredbyPeptide-inducedalpha5beta1IntegrinPriminginMesenchymalSkeletalCells.JBiolChem.2015.290(11):6903-12.[17]SharifiAM,MottaghiS.Finasterideasapotentialtooltoimprovemesenchymalstemcelltransplantationformyocardialinfarction.MedHypotheses.2012.78(4):465-7.[18]WuR,TangY,ZangW,etal.MicroRNA-128regulatesthedifferentiationofratbonemesenchymalstemcellsintoneuron-likecellsbyWntsignaling.MolCellBiochem.2014.387(1-2):151-8.[19]FreeseJL,PinoD,PleasureSJ.Wntsignalingindevelopmentanddisease.NeurobiolDis.2010.38(2):148-53.[20]CaiSX,LiuAR,HeHL,etal.Stablegeneticalterationsofbeta-cateninandROR2regulatetheWntpathway,affectthefateofMSCs.JCellPhysiol.2014.229(6):791-800.[21]AbdallahBM,JafariA,ZaherW,QiuW,KassemM.Skeletal(stromal)stemcells:anupdateonintracellularsignalingpathwayscontrollingosteoblastdifferentiation.Bone.2015.70:28-36.[22]VarelasX,MillerBW,SopkoR,etal.TheHippopathwayregulatesWnt/beta-cateninsignaling.DevCell.2010.18(4):579-91.[23]AlmeidaM,HanL,BellidoT,ManolagasSC,KousteniS.Wntproteinspreventapoptosisofbothuncommittedosteoblastprogenitorsanddifferentiatedosteoblastsbybeta-catenin-dependentand-independentsignalingcascadesinvolvingSrc/ERKandphosphatidylinositol3-kinase/AKT.JBiolChem.2005.280(50):41342-51.80 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重庆医科大学博士研究生学位论文[34]HaraK,YamadaY,NakamuraS,UmemuraE,ItoK,UedaM.Potentialcharacteristicsofstemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteethcomparedwithbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsformineralizedtissue-formingcellbiology.JEndod.2011.37(12):1647-52.[35]IshidaK,AcharyaC,ChristiansenBA,YikJH,DiCesarePE,HaudenschildDR.Cartilageoligomericmatrixproteinenhancesosteogenesisbydirectlybindingandactivatingbonemorphogeneticprotein-2.Bone.2013.55(1):23-35.[36]MaioliM,SantanielloS,MontellaA,etal.HyaluronanestersdriveSmadgeneexpressionandsignalingenhancingcardiogenesisinmouseembryonicandhumanmesenchymalstemcells.PLoSOne.2010.5(11):e15151.82 重庆医科大学博士研究生学位论文综述二NT、FGF、BMP-2及TGF对骨折愈合作用机制的研究进展【摘要】影响骨折愈合的因素较多，其具体分子机制的研究近年来方兴未艾，本文主要通过总结近年来对于影响骨折愈合的神经生长因子的表达，成纤维生长因子的表达，形态发生蛋白的表达和转化生长因子的表达研究进展，分析其具体机制，总结出骨折愈合受多因子复合作用的影响，因此对于骨折不愈合的治疗也要针对以上因子进行干预，从而达到良好的治疗效果，本文总结现阶段的研究现状，为今后关于骨折愈合的因素的研究指明了方向。关键词：生长隐私，骨折愈合，骨折愈合主要分为诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和重建期，骨折愈合中阻碍任何一个环节均会影响骨折的愈合。骨折愈合参与的细胞较多，不同阶段均有不同细胞参与，开放性骨折常伴有细菌感染，而细菌感染释放的毒素就会干扰或者损伤骨折愈合相关细胞的正常代谢和功能，从而阻断骨折愈合的过程，因此细菌感染是骨折不愈合或延迟愈合的主要的原因之一，骨折愈合的过程就是成骨细胞形成骨质并钙化，细菌导致局部炎症介质释放，最终引起免疫反应导致成骨细胞坏死或者凋亡，造成成骨功能障碍，最终导致不愈合[1-5]。生长因子是人体内重要信号传递分子，参与细胞分化、增殖、凋亡、基质代谢等多个方面的调控[1,2]。伴随骨折愈合研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子在骨折愈合中的作用价值；本研究主要将近年来参与骨折愈合过程的相关生长因子的临床相关资料作综述，以为相关实践研究提供借鉴价值[6.7]。1神经生长因子的表达有研究发现神经营养因子-3（NT-3）通过成骨细胞表达的神经营养因子受体（TRKC）刺激成骨细胞增生，NT-3和TRKC在骨折患者体内通过自分泌或旁分泌促进骨形成[19]。在骨折愈合过程中TGF-β能够促进NT-3mRNA表达，使NGF与NT-3mRNA在骨折手术后2天达到最高峰值，发挥促进骨折愈合作用。在动物实验中[20,21]，在成兔下颌骨牵张成骨手术后模型局部注射人NGFβ，结果得出该组83 重庆医科大学博士研究生学位论文再生骨小梁和质量均获得显著提高，并且可刺激成骨细胞分化，增强神经组织支配功能，促进愈伤组织成熟，缩短手术巩固期，减少骨折愈合并发症发生风险。虽然经临床动物实验研究表明NGF在骨折愈合中发挥重要作用，但是其来源缺乏，医疗费用高，加之最佳使用时机等问题尚未解决，因此其临床应用价值仍需进一步研究[8,9]。2.成纤维生长因子的表达FGF是首次发生在牛脑垂体的一种多肽，具有酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2种表达形式[10]。FGF既可以刺激细胞游走转移，又能够加速成纤维细胞有丝分裂，成骨细胞增殖、分化等，同时可以刺激骨折断端毛细血管的生成，促进软骨细胞增殖、分化，从而发挥促进骨折愈合的作用。经临床研究表明[11,12]，bFGF是重要的骨合成代谢调节影戏，可有效刺激骨形成、骨吸收，因此bFGF在骨折愈合过程所发挥的作用显著优于aFGF。临床研究中将重组人bFGF（rhbFGF）应用于截骨手术部位，结果显示，rhbFGF以剂量依赖的方式促进骨折愈合[13]。bFGF在骨折患者体内通过自分泌或旁分泌方式释放到细胞外，和FGF受体（FGFR）相互结合，然后经过信号转导通路促进骨细胞分裂、增殖，以合成骨基质。有研究指出[14]，FGFR-2水平下降可延迟骨折愈合时间，FGFR-3基因突变可阻碍润骨细胞分化。3.形态发生蛋白的表达（BMP-2）大量相关动物实验、理论证明BMP-2具有诱导成骨的作用，但是在临床应用中对评估精确BMP-2诱导成骨能力价值及使用安全系那个仍存在诸多疑问。BMP-4结构、功能近似于BMP-2，也可促成骨细胞的分化。于骨折愈合初期，BMP-4作主要局部的刺激因子能促骨痂形成，但是BMP-2的过度表达，会促进软骨的形成并促进分化[15]。BMP-7主要生物作用就是骨折部位血肿未分化的MSCs促分化骨、软骨细胞，并经钙质沉积促进新骨形成，从而达到促进骨折愈合的效果。经临床研究发现[16]，在骨缺损模型中rhBMP-7组骨折部位愈合组织直径、体积、骨矿物质含量均显著大于对照组，对比差异均具有统计学意义，由此可知rhBMP-7促进骨折愈合同时，可生产正常愈合骨。即使目前临床对于BMP的研究较为深入，但是对于rhBMP在人体内半衰期短、容易降解，靶细胞对BMP敏感性低，治疗费用高、安全系数低等问题尚未解决。84 重庆医科大学博士研究生学位论文4.转化生长因子骨折愈合初期，TGF-β不仅可从脱颗粒相关血小板释放，而且能够从软骨痂中增生、分化细胞合成而来，最后通过诱导成骨细胞活性、增殖，刺激膜内成骨，并刺激成骨细胞合成Ⅰ型胶原、骨连接素[17]。TGF-β是有效的趋化因子，可以刺激间充质肝细胞、软骨细胞、成骨细胞增殖，并且能够诱导细胞外蛋白的生成，在软骨生成及软骨成骨中起着重要作用。经临床动物实验[18-22]，即通过建立成年兔胫骨中段骨缺损模型，缺损部位置入可持续释放TGF-β（剂量10mg/d）渗透泵。2个月后观察结果显示TGF-β可以增加最大弯曲度，同时可促进骨痂的形成，从而促进骨折愈合[23-25]。5.总结骨折愈合过程非常复杂，受细胞、分子、遗传等多种因素影响。虽然，目前临床对各种生长因子在骨折愈合过程中的作用机制进行一些较为深入的研究，且部分生长因子已经在临床中开展应用，但是各种生长因子对成骨细胞、软骨细胞等的增殖、分化及其在骨折愈合不同阶段的对应作用机制，特别是各个生长因子间的相互作用关系尚不清楚，是今后临床研究中需要探索的重要问题。另外，对于如何在骨折愈合过程中恰当使用生长因子，各个生长因子间联合作用、剂量比例等问题需进行深入的研究予以补充，旨在为骨折患者可获得有效治疗和促进骨愈合提供安全、有效的治疗措施。参考文献[1]LuC,SalessN,WangX,etal.Theroleofoxygenduringfracturehealing.BONE,2013,52:220-229[2]HeppenstallRB,GoodwinCW,BrightonCT.Fracturehealinginthepresenceofchronichypoxia.JBONEJOINTSURGAM.1976,58:1153-1156[3]WarrenSM,SteinbrechDS,MehraraBJ,.Hypoxiaregulatesosteoblastgeneexpression.JSURGRES,2001,99:147-155[4]AkenoN,Czyzyk-KrzeskaMF,GrossTS,etal.Hypoxiainducesvascularendothelialgrowthfactorgenetranscriptioninhumanosteoblast-likecellsthroughthehypoxia-induciblefactor-2alpha.ENDOCRINOLOGY.2001.142:959-962[5]BouletreauPJ,WarrenSM,SpectorJA,etalHypoxiaandVEGFup-regulate85 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重庆医科大学博士研究生学位论文致谢首先深深感谢我的导师蒋电明教授！感谢导师在我攻读博士阶段对我研究工作和学习生活中的精心指导和关怀。导师博学的专业知识、敏锐的科研洞察力、对科研开展的把控能力让我无比敬佩。导师对科研事业的热爱和执着，并为之坚持不懈的信念深深影响了我，将是我学习的楷模！对于我在研究工作中出现的种种问题和困难，导师不断的给予分析和指正，点拨我的科研思路，让我对科研和自己有了全新的认识，这将督促我在今后的工作和学习不断努力！衷心感谢重医附一院骨科的各位老师对我在重医一附院工作学习的关怀和帮助。衷心感谢我的同窗好友任逸众博士、白明博士、贾彦波博士、叶楠博士、辛大奇博士、李亚光博士等人在我实验、临床工作及学习生活等多方面给予的大量关心、支持和帮助，与你们的友谊伴我度过了难忘的美好时光。最后特别感谢我的家人在我求学生涯中对我的无私奉献，三年来对我精神上和物质上的无私付出、无尽的支持和鼓励让我走到了今天！88 重庆医科大学博士研究生学位论文攻读博士期间发表的论文及参加申报的课题发表SCI文章1篇，分值：2.664分TNF-αisupregulatedinT2DMpatientswithfractureandpromotestheapoptosisofosteoblastcellsinvitrointhepresenceofhighglucose发表在Cytokine杂志89