高浓度褪黑素调控Septin4蛋白介导成骨细胞凋亡的机制研究

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分类号：R682.3单位代码：10159密级：公开学号：201520256硕士学位论文中文题目：高浓度褪黑素调控Septin4蛋白介导成骨细胞凋亡的机制研究英文题目：MechanismsofSeptin4-mediatedapoptosisinducedbyhighconcentrationofmelatoninininhumanfetalosteoblasticcells1.19论文作者：赵思超指导教师：朱悦教授学科专业：外科学完成时间：2018年2月I 中国医科大学硕士学位论文高浓度褪黑素调控Septin4蛋白介导成骨细胞凋亡的机制研究MechanismsofSeptin4-mediatedapoptosisinducedbyhighconcentrationofmelatoninininhumanfetalosteoblasticcells1.19论文作者赵思超指导教师朱悦教授申请学位医学硕士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科外科学研究方向骨科论文起止时间2016年3月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年2月I 中国医科大学硕士学位论文摘要目的：特发性脊柱侧凸（IdiopathicScoliosis，IS）是生长发育期间原因未知的脊柱侧凸，表现为一种三维的脊柱畸形，患病率呈上升趋势，其长期威胁着患者的健康，可能导致许多不良结果，极大的降低人们的生活质量。特发性脊柱侧凸进展最快的时间，发生在少年生长发育最快的年龄，也就是骨骼发育、成骨细胞增殖最活跃的时间段。褪黑素可以影响骨代谢，有大量证据表明其可以影响特发性脊柱侧凸的进展。我们以前的研究发现，高浓度褪黑素可以显著抑制成骨细胞增殖，介导其发生内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)甚至凋亡。因此，探讨高浓度褪黑素介导成骨细胞内质网应激及细胞凋亡的机制可能为治疗特发性脊柱侧凸提供新的思路。外界刺激可导致细胞内质网生理功能发生紊乱，引发内质网应激，内质网通过激活未折叠蛋白反应以减轻细胞损伤，恢复细胞功能，然而过强或长时间的ERS，可引起细胞凋亡。有学者研究指出Septin4可能是ERS的感受器，作为ERS的靶点调控细胞的生理过程。Septin4蛋白被认为是细胞骨架的一部分，并且参与许多重要的细胞生理过程，如细胞转运、有丝分裂、纤维化和细胞凋亡。有研究指出Septin4可以通过细胞凋亡途径在小鼠肿瘤模型或者人类患者中抑制肿瘤发展，减弱由日本血吸虫诱导的肝纤维化进程发展。然而，对于Septin4是否参与骨代谢疾病，比如褪黑素调节特发性脊柱侧凸的进展方面的研究，尚未有人报道。本研究的目的旨在明确Septin4在高浓度褪黑素介导成骨细胞的内质网应激以及细胞凋亡过程中的变化，探讨其作用机制。从这项研究中获得的信息可能对于探索使用褪黑素治疗特发性脊柱侧凸提供新的视野和方向。研究方法：本实验采用MTT法测定成骨细胞活力，使用AnnexinV-FITC/PI双染细胞、流式细胞术分析凋亡和Westernblot检测来明确Septin4参与高浓度褪黑素介导的人成骨细胞（hFOB1.19细胞）内质网应激以及细胞凋亡中的变化。然后通过对Septin4过表达，解析其对高浓度褪黑素介导的人成骨细胞内质网应激和细胞凋亡的作用。此外，我们将应用鬼笔环肽染色纤维状肌动蛋白，以探讨过表达Septin4对高浓度褪黑素介导hFOB细胞骨架的影响以及细胞形态的变化。III 中国医科大学硕士学位论文结果：1.高浓度褪黑素抑制hFOB1.19细胞的活力，促进细胞凋亡，增加Septin4、ERS和凋亡通路相关基因的表达。2.过表达Septin4加强高浓度褪黑素诱导人成骨细胞的细胞活力下降，促进细胞凋亡的能力，且增加内质网应激和细胞凋亡通路相关基因的表达。3.过表达Septin4加重人成骨细胞中由高浓度褪黑素诱导的细胞骨架的破坏以及细胞形态学变化的程度。结论：本研究证实Septin4参与并增强了由高浓度褪黑素介导的人成骨细胞内质网应激和细胞凋亡过程，加重高浓度褪黑素对成骨细胞细胞骨架的破坏以及细胞形态学变化的程度。关键词：特发性脊柱侧凸；人成骨细胞；Septin4蛋白；褪黑素；细胞凋亡；内质网应激；细胞骨架课题资助：国家自然科学基金（No.81472044）IV 中国医科大学硕士学位论文AbstractBackgroundandobjective:Idiopathicscoliosis(IS)isanunknowncauseofscoliosisduringgrowthanddevelopment,whichpresentsasa3Ddeformityofthespinewithanincreasingprevalence.Thediseasethreatenthehealthofpatientsformanyyearsandmaycausemanyproblems.Asaresult,people'squalityoflifeisgreatlyreduced.Thefastesttimeforthedevelopmentofidiopathicscoliosisoccursinthefastestgrowingageofjuveniles,thatis,themostactiveperiodofbonedevelopmentandosteoblastproliferation.Melatonincanaffectbonemetabolism,andthereisalotofevidencethatitcanaffecttheprogressofidiopathicscoliosis.Ourpreviousstudyfoundthathighconcentrationsofmelatonincouldsignificantlyinhibittheproliferationofosteoblasts,mediatingendoplasmicreticulumstress(ERS)andevenapoptosis.Therefore,toexplorethemechanismofhighconcentrationsofmelatonin-mediatedERSandapoptosisinosteoblastsmayprovideanewideaforthetreatmentofidiopathicscoliosis.Externalstimulationcanleadtodisruptionofthephysiologicalfunctionoftheendoplasmicreticulum,triggeringERS.Endoplasmicreticulumcanreducecelldamageandrestorecellfunctionbyactivatingunfoldedproteinreaction.However,excessiveorprolongedERScaninduceapoptosis.SomescholarshaveconcludedthatSeptin4mayserveasareceptorofERStoregulatecellphysiology.Septin4isconsideredasapartofcytoskeletonandisinvolvedinmanyimportantcellularphysiologicalprocesses,suchascelltransport,mitosis,fibrosisandapoptosis.StudieshaveshownthatSeptin4caninhibittumordevelopmentinmousetumormodelsorhumanpatientsthroughtheapoptoticpathwayandattenuatetheprogressofhepaticfibrosisinducedbySchistosomajaponicumaswell.However,thestudyofwhetherSeptin4participatesinbonemetabolicdiseases,suchasmelatoninregulationofidiopathicscoliosis,hasnotbeenreportedyet.TheaimofthisstudywastodeterminethechangesandtoinvestigateitsmechanismwhenhighconcentrationsofmelatoninmediatingcellERSandcellapoptosisinhFOBcells.TheinformationobtainedfromthisstudymayprovideanewvisionanddirectionforexploringtheuseV 中国医科大学硕士学位论文ofmelatonininthetreatmentofidiopathicscoliosis.Methods:MTTassaywasusedtodetermineosteoblastactivityinthisexperiment.AnnexinV-FITC/PIdoublestainingcellsandflowcytometrywereusedtoanalyzeapoptosisandWesternblotassaydetectiontoidentifySeptin4involvedinhighconcentrationsofmelatoninmediatedendoplasmicreticulumstressandapoptosisinhumanosteoblasts.ThenbyoverexpressionofSeptin4,theeffectsofhighconcentrationsofmelatoninmediatedendoplasmicreticulumstressandapoptosisinhumanosteoblastswereanalyzed.Inaddition,wewillusephalloidinstainingF-actin,todeterminetheeffectofSeptin4onhighconcentrationsofmelatonininducedhFOBcytoskeletonandchangesofcellmorphology.Results:1.HighconcentrationsofmelatonininhibitstheactivityofhFOB1.19cells,promotesapoptosis,andincreasestheexpressionofSeptin4,ERSandapoptosispathwayrelatedgenes.2.OverexpressionofSeptin4enhancedthedeclineofcellviabilityandapoptosisofhFOBcellsinducedbyhighconcentrationsofmelatonin,andtheexpressionofERSandapoptoticpathwayrelatedgenesalsoincreased.3.OverexpressionofSeptin4aggravatedthedestructionofcytoskeletonandthedegreeofcellmorphologicalchangesinducedbyhighconcentrationsofmelatonin.Conclusion:ThisstudyconfirmedthatSeptin4increasedtheprocessofendoplasmicreticulumstressandapoptosismediatedbyhighconcentrationsofmelatonininhumanosteoblasts,aggravatesthedegreeofthedestructionofosteoblastscytoskeletonandthechangeofcellmorphologyinducedbyhighconcentrationsofmelatonin.Keywords:Idiopathicscoliosis,HFOB1.19cells,Septin4,Melatonin,Apoptosis,Endoplasmicreticulumstress,CytoskeletonVI 中国医科大学硕士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称ISIdiopathicscoliosis特发性脊柱侧凸hFOB1.19HumanFetalOsteoblasticCells1.19人胎儿成骨细胞系1.19ERSEndoplasmicreticulumstress内质网应激UPRUnfoldedproteinresponse未折叠蛋白反应GRP78glucose-regulatedprotein78KD葡萄糖调节蛋白78BIPimmunoglobulinheavychainbindingprotein免疫球蛋白重链结合蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)3-(4，5-二甲基噻-2）MTT-2,5-diphenyl-2，5-二苯基-2-H-tetrazoliumbromide四氮唑溴盐PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液ECLEnhancedchemiluminescence增强化学发光DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚VII 中国医科大学硕士学位论文目录摘要............................................................................................................................IIIAbstract.........................................................................................................................V英文缩略语................................................................................................................VII1前言............................................................................................................................12材料与方法................................................................................................................32.1实验材料及试剂.................................................................................................32.1.1细胞系培养与处理......................................................................................32.1.2抗体及主要实验材料..................................................................................42.2主要设备与仪器.................................................................................................62.3实验方法.............................................................................................................72.3.1细胞活性检测...............................................................................................72.3.2细胞凋亡检测..............................................................................................72.3.3Westernblot检测相关蛋白..........................................................................82.3.4鬼笔环肽染色...............................................................................................92.3.5统计分析.......................................................................................................93结果..........................................................................................................................103.1高浓度褪黑素降低hFOB1.19细胞的活力，促进细胞凋亡........................103.2高浓度褪黑素对Septin4表达的作用..............................................................113.3高浓度褪黑素增加ERS和凋亡通路相关基因的表达...................................113.4过表达Septin4加强高浓度褪黑素抑制hFOB细胞活力和促进细胞凋亡123.5过表达Septin4增加高浓度褪黑素介导hFOB1.19细胞ERS和凋亡通路相关基因的表达..........................................................................................................143.6过表达Septin4增强高浓度褪黑素诱导hFOB1.19细胞细胞骨架的破坏以及细胞形态学变化的程度......................................................................................154讨论..........................................................................................................................175结论..........................................................................................................................19本研究创新性的自我评价..........................................................................................20参考文献......................................................................................................................21综述............................................................................................................................26VIII 中国医科大学硕士学位论文致谢............................................................................................................................33个人简历......................................................................................................................34IX 中国医科大学硕士学位论文1前言脊柱侧凸也称作脊柱侧弯，是一种三维的脊柱畸形,其表现不仅在矢状位和冠状位的序列上存在异常，在水平面也存在轴向旋转[1]。脊柱侧凸的典型表现为剃刀背，其具体表现为患者两肩高低不平，身体前屈时背部一侧隆起呈剃刀样，一侧胸廓塌陷而另一侧隆起，同时可伴有骨盆倾斜和跛行，Cobb角超过10°可诊断脊柱侧凸[2]。脊柱侧凸如任其发展，最终可形成严重脊柱侧凸，导致躯干严重畸形。特发性脊柱侧凸（IdiopathicScoliosis，IS）是生长发育期间原因未知的脊柱侧凸，约占脊柱侧凸的70%-90%[3],其根据发病年龄主要分为三种类型：婴儿型（0～3岁）；少儿型（3～10岁）；青少年型（10岁后）。青少年特发性脊柱侧凸的患病率为0.47%-5.2%，且呈上升趋势，其中女孩脊柱弯曲的发生率和严重程度要高于男孩[4]。青少年特发性脊柱侧凸以Cobb角度的大小分型：当其小于10°时可以考虑为处在正常变异的范围内，因为它几乎没有发展的趋势，10°-20°为轻型，20°-30°为中型，30°以上为重型[5]，严重的脊柱侧凸长期威胁着患者的健康，可能导致许多不良结果，例如：背部疼痛，肺部疾病，残疾，美观问题，心理疾病等等，这些都极大的降低了人们的生活质量[6]。目前已经证实的是，骨的形成是通过一个连续运行的重塑过程来实现的，该过程涉及由破骨细胞吸收旧骨，随后由成骨细胞形成新骨[7]。脊柱畸形的发展和脊柱的发育进程密不可分[8]。特发性脊柱侧凸进展最快的时间，发生在少年生长发育最快的年龄，也就是骨骼发育、成骨细胞增殖最活跃的时间段[9-12]。还有报道指出：患有特发性脊柱侧凸的女孩在纠正侧凸导致的高度损失后，其站立身高明显高于同龄的对照组人群的平均身高[13]。褪黑素可以影响骨代谢[14]，有大量证据表明其可以影响特发性脊柱侧凸的进展。Thillard报道了将鸡的松果体切除，可诱导其发育出与人类特发性脊柱侧凸相似的脊柱畸形[15]。后来，Machid等学者报道了在松果体切除术后的双足脊椎动物模型或未进行松果体切除的、褪黑素缺乏的C57BL/6J双足小鼠动物模型上，采用松果体的自体移植[16]或腹膜内注射褪黑素[17]的方式可以在一定程度上减缓这些动物模型脊柱侧凸的进展。不仅在实验动物上，经证实，青少年特发性脊柱侧凸患者的血清褪黑素水平显著低于对照组[18]，而且有研究表明，褪黑素的缺乏在特发性脊柱侧凸的预后中起着关键作用，而褪黑素补充剂可以预防特发性脊柱侧凸的进展，特别1 中国医科大学硕士学位论文是在角度小于35°的情况下[19]。这些发现清楚地表明，褪黑素水平的降低与脊柱畸形的发展之间存在关联。目前，褪黑素治疗特发性脊柱侧凸具有不确定性[20]，这可能因为褪黑素的浓度与特发性脊柱侧凸的进展相关。我们前期的的研究发现，低浓度褪黑素促进成骨细胞增殖[21]，而高浓度褪黑素可以显著抑制成骨细胞增殖[22]，介导其发生内质网应激甚至凋亡。因此，我们推测高浓度褪黑素介导成骨细胞内质网应激和细胞凋亡可能是其治疗特发性脊柱侧凸的关键所在。内质网(ER)是细胞内十分重要的细胞器，同时它也是细胞重要的钙离子贮存库。内质网参与许多重要的功能，如蛋白的折叠、合成、分泌以及转译后的修饰等，不仅如此，它还能调节细胞对外界应激的反应、细胞内钙离子的水平变化以及胆固醇的合成[23]。外界刺激可导致细胞内质网生理功能发生紊乱，引起钙稳态失衡、钙超载，而钙离子稳态的改变和未折叠或错误折叠蛋白质在内质网内的蓄积可以引发内质网应激(Endoplasmicreticulumstress，ERS)[24,25]，其包括钙离子从内质网腔排空、糖基化抑制、二硫键结合减少、突变蛋白质表达等过程。任何有害条件下内质网应激会导致降低蛋白合成，增加分子伴侣的表达,促进蛋白质的正确折叠和细胞复苏[26]，内质网通过激活未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)[27]以保护由ERS所引起的细胞损伤，恢复细胞功能，然而，过强或长时间的ERS，可引起细胞凋亡[28-30]。未折叠蛋白反应是由分子伴侣和3个感受蛋白介导的，内质网分子伴侣是GRP78/BIP,另外三个感受蛋白是PERK、IRE-1和ATF6。当无外界刺激或外界刺激程度不强时，PERK、ATF6、IRE-l与GRP78处于结合状态，此时他们并无活性。然而当外界刺激程度增强导致产生ERS时，GRP78与3种跨膜蛋白解离，转而去结合堆积产生的未折叠蛋白。感受蛋白此时被活化，激活未折叠蛋白反应，减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累，这一过程可逐渐恢复内质网的正常功能，所以说，这是内质网应激诱导的生存途径[23,31-34],当外界刺激程度过于严重或者刺激时间过长以至于破坏了内质网的功能时，将会启动由ERS所介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。内质网应激与机体多种疾病的发生密切相关，这主要与内质网应激导致细胞凋亡有关。其在骨细胞的生长、凋亡及相关骨病中，发挥着重要的调节作用。实验发现在不同强度的ERS反应下，对成骨细胞有双向调控作用[35]。有学者运用siRNAscreen技术发现，Septin4高表达于HeLa细胞的内质网及高尔基体膜表面，当受到2 中国医科大学硕士学位论文外界刺激时，其在质膜上迅速重新分布，引起细胞膜钙离子内流[36]，这提示Septin4可能是ERS的感受器，作为ERS的靶点调控细胞的生理过程。Septins蛋白家族最初在酵母中被发现，属于一个高度保守的聚合GTP结合蛋白家族，长期以来一直被认为是细胞骨架的一部分[37]。已有文献报道，Septins基因在除原生生物以及植物以外的大多数真核生物细胞中广泛表达，比如真菌、果蝇和哺乳动物中，而且其基因序列在不同的物种之间具有很高的同源性[38]。Septin4从属于Septins家族亚型，目前已经证实，其存在于大多数真核生物细胞中，在人类，它位于染色体17q23[39]。Septin4具有多个剪接变体[40]，并且参与许多重要的细胞生理过程，如细胞转运、有丝分裂、纤维化和细胞凋亡[41]。学者ElhasidRonit的研究报告指出，Sept4_i2/ARTS（Setpin4的两种主要剪接变体之一）被证明可以通过细胞凋亡途径在小鼠肿瘤模型或者人类患者中抑制肿瘤发展。不仅如此，研究还显示Sept4_i2/ARTS缺陷小鼠因为其具有对凋亡的抵抗作用而导致促进了肿瘤的进展[42]。在DuanYN等学者的研究中，他们发现Septin4可通过细胞凋亡途径减弱由日本血吸虫诱导的肝纤维化进程发展[43-45]。此外还有研究显示，在帕金森疾病模型中，Septin4的缺乏可通过减少多巴胺能神经传递并且增强α-突触核蛋白神经毒性而显著增加神经病理学以及运动功能的恶化[46]。ParicioNuria的研究提示Septin4通过调节E3泛素连接酶Nedd4参与帕金森病[47]。然而，对于Septin4是否参与骨代谢疾病，比如褪黑素调节特发性脊柱侧凸的进展方面的研究，尚未有人报道。2材料与方法2.1实验材料及试剂2.1.1细胞系培养与处理正常人胎儿成骨细胞系hFOB1.19由SubramaniamMalayannan博士友情馈赠[48],hFOB细胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DME/F12（1:1）培养基培养，放置于潮湿环境中含有5%CO2，37℃的恒温箱中培养。细胞隔日换液，待细胞长满，铺满培养瓶/培养皿单层后，使用含有0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶在37℃环境下常规消化1-2min，再加入含血清培养基中和胰蛋白酶，轻柔吹打成单细胞悬液，计数并调整细胞密度，传代培养。成骨细胞在传代培养8–11代中使用，在给予细胞处理因素前24小时处理细胞，使其密度在104个细胞/cm2。3 中国医科大学硕士学位论文计算好量褪黑素用DMSO溶解后，再用含10%FBS的培养基定容至含0.2%DMSO和10%FBS的褪黑素溶液母液，然后再用含有0.2%DMSO和10%FBS的培养基稀释至各个浓度（0mM，2mM，4mM和6mM）的褪黑素溶液。每次药液现用现配。Flag-Septin4过表达质粒的构建与扩增购自上海吉凯基因化学技术有限公司。基因名称：SEPT4(NM_004574)，物种：Human。载体名称：GV141XhoI/KpnI酶切，元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-Neomycin。根据说明书计算转染混合物中各个成分的用量，用Lipofectamine2000进行细胞转染。因质粒基因的表达在瞬转后48h达到高峰，所以在转染6h后细胞换液用褪黑素溶液作用细胞。褪黑素处理细胞42h后，收细胞用实验检测。细胞转染效率用Westernblot检测Flag及Septin4蛋白的表达来检测。2.1.2抗体及主要实验材料材料来源DME/F12(1:1)培养基HyClone,犹他，美国0.25％胰蛋白酶HyClone,犹他，美国胎牛血清（FBS）HyClone,犹他，美国ECLThermoFishercientific，美国蛋白彩虹markerThermoFisherScientific，美国DAPIsolarbio,中国MTTSigma，美国二甲基亚砜（DMSO）Sigma，美国牛血清蛋白（BSA）Sigma，美国Septin4plasmidsGenechem,上海，中国Lipofectamine2000Invitrogen,美国4 中国医科大学硕士学位论文Opti-MEM培养基ThermoFisherScientific，美国鼠抗-Septin4抗体1:4000;abcam,上海，中国兔抗-GRP94抗体1:1000;abcam,上海，中国兔抗-GRP78抗体1:1000;abcam,上海，中国兔抗-caspase-3抗体1:1000;CellSignalingTechnology,美国鼠抗-Flag抗体1:1000;CellSignalingTechnology,美国鼠抗-β-actin抗体1:10000;proteintech,美国羊抗鼠第二抗体北京中杉金桥生物技术有限公司，中国羊抗兔第二抗体北京中杉金桥生物技术有限公司，中国PVDF膜Millipore，美国BCA蛋白定量试剂盒康为试剂，中国RIPA蛋白裂解液碧云天，中国PMSF碧云天，中国AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒Dojindo,日本丙烯酰胺索莱宝，中国TrisBase索莱宝，中国TEMED索莱宝，中国APS索莱宝，中国甘氨酸索莱宝，中国Tween20索莱宝，中国5 中国医科大学硕士学位论文十二烷基磺酸钠(SDS)索莱宝，中国培养瓶、培养板、吸管等耗材CorningCoster，美国2.2主要设备与仪器仪器来源超净工作台SW-CJ-IF，苏州，中国细胞培养箱Thermo，scientific，美国倒置显微镜Olympus，日本高速冷冻离心机STRATOSKENDRO，美国振荡恒温水浴锅常州高德仪器制造有限公司，中国光谱扫描式微板分光光度计MOLECULARDEVICE，美国电泳仪Bio-rad，美国振荡恒温金属浴仪Eppendorf，德国超纯水器CascadaBio，美国压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂，中国多功能台式摇床Eppendorf，德国电子称量仪Sartorious，美国倒置荧光显微镜Olympus，日本漩涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国立式超低温保存冰箱青岛海尔特种电器有限公司，中国6 中国医科大学硕士学位论文立式医用低温冰箱中科美菱低温科技有限责任公司，中国低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国层析冷柜北京博医康实验仪器有限公司，中国2.3实验方法2.3.1细胞活性检测用MTT试剂盒检测细胞活力。（1）将hFOB细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，度过24h让细胞贴壁后处理细胞。（2）处理方式：第一部分实验单纯用0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h；第二部分实验需要对细胞转染对照质粒或Flag-Septin4质粒后再换液用褪黑素处理细胞，hFOB细胞随机分为4组：1.转染对照质粒；2.转染对照质粒且暴露于褪黑素（2mM，4mM和6mM）；3.转染Flag-Septin4质粒；4.转染Flag-Septin4质粒且暴露于褪黑素（2mM，4mM和6mM），细胞转染48h且褪黑素处理42h。（3）不同的处理因素作用于细胞后，各孔细胞换液为90µL新鲜培养基，加入配置好的10μlMTT溶液（5mg/ml），在37˚C孵育4h后，小心弃上清液，然后各孔加入110μlDMSO。避光环境置于缓慢摇床低速震荡10min。在490nm的波长用酶标仪测量每个孔的吸光度。各组成骨细胞的相对活力=（处理组孔的值-空白组的值）/（对照组的值-空白组的值），用5组独立的实验数据进行分析。2.3.2细胞凋亡检测用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。（1）将hFOB细胞以每孔105个细胞的密度接种于6孔板，度过24h让细胞贴壁后处理细胞。（2）处理方式：第一部分实验单纯用0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h；第二部分实验需要对细胞转染对照质粒或Flag-Septin4质粒后再换液用褪黑素处理细胞，hFOB细胞随机分为4组：1.转染对照质粒；2.转染对照质粒且暴露于4mM褪黑素；3.转染Flag-Septin4质粒；4.转染Flag-Septin47 中国医科大学硕士学位论文质粒且暴露于4mM褪黑素，细胞转染48h且褪黑素处理42h。（3）用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，（胰蛋白酶提前在37℃水浴箱内预热）在4°C环境下以1000rpm/min离心3min。（4）弃上清液，用冷PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后在4°C环境下以1000rpm/min离心3min，弃上清。（5）各组细胞用500μlBindingbuffer重悬，转移至流式管内。各实验组加入FITC（5μl）和PI（5μl）。悬浮液在室温下孵育20min后用流式细胞仪分析。实验重复3次。2.3.3Westernblot检测相关蛋白（1）细胞按照上述方式分组，经过处理后，提取总蛋白。在冰上用细胞刮刀轻柔刮取细胞，将细胞及残存培养基转移至离心管中，用冷PBS冲洗培养皿2次，将其一并收取至离心管中，在4°C环境下以2000rpm/min离心10min。弃上清液，用冷PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后在4°C环境下以2000rpm/min离心10min，彻底吸取上清全部弃去。加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，重悬细胞置于冰上裂解30min，其中每经过10min间断用漩涡振荡器将细胞混匀。在4°C以12000rpm/min离心20min提取上清。（2）用BCA法测定蛋白浓度，绘制蛋白标准曲线计算各组蛋白浓度。统一各组蛋白浓度，根据计算结果用无菌双蒸水和6×LoadingBuffer稀释蛋白样品，每个样品体积12μl，含蛋白60μg。用振荡恒温金属浴仪在99℃以400rpm/min速度震荡，加热5min。瞬离各样品后于-80°C保存备用。（3）电泳。根据说明书配置SDS-PAGE凝胶，分离胶浓度10%，上层浓缩胶凝固后置于潮湿环境保存备用。配制电泳缓冲液：甘氨酸14.4g，Tris3.03g，SDS1g溶于1000ml双蒸水，混匀后组装垂直电泳装置。蛋白样品再次以400rpm/min速度震荡，加热5min后瞬离。电泳槽内加入电泳缓冲液，内外槽无渗漏，小心拔出胶板内梳子，选择孔道小心加入5μl蛋白彩虹marker及各组全部12μl蛋白样品，避免样品溢出。正确连接电源，以80V恒电压开始电泳，蛋白样品及Marker电泳至分离胶后改变电压为120V，直至样品到底后终止。（4）转膜。电泳过程中准备转膜装置，配制TransBuffer：甘氨酸14.4g，Tris3.03g，800ml双蒸水，再加入200ml甲醇避免挥发于4℃预冷。打开转印夹，两面各放置海绵及3层洁净滤纸，置于TransBuffer内浸泡。电泳结束后，根据Marker位置及目的蛋白分子量的大小切取胶条，整齐放置于转印夹黑色面滤纸上，以分子8 中国医科大学硕士学位论文量50KD划分大小，分别置于不同的转印夹，并标记。根据胶条大小裁剪PVDF膜，标记后浸泡于甲醇中激活，再对应覆盖再胶条上，主意贴合紧密完整无气泡、杂质。将三层滤纸及海绵顺次放置于膜上，合上转印夹，插入转膜槽，倒入TransBuffer，放入冰盒。于4℃层析冷柜内正确连接电极、电源，以80V恒压持续转膜，小分子量蛋白转膜60min，大分子量90min，注意初始电流在200mA左右。（5）孵育抗体。用TBST溶液和BSA粉末配置5%BSA的封闭液和1%BSA的抗体孵育液。转膜结束后，迅速用镊子将PVDF膜转至封闭液中，在缓慢摇床上封闭60-90min。按照说明书稀释各目标蛋白抗体，将PVDF膜完全浸泡于抗体中在4℃环境中置于缓慢摇床孵育过夜。第二天取出PVDF膜，用TBST溶液在快速摇床下洗涤4次，每次15min，再将其浸泡于稀释好的对应的二抗中。室温下在缓慢摇床孵育2h，再用TBST溶液洗涤4次。（6）发光。根据膜的数量将ECL发光液A、B以1:1混匀，PVDF膜置于胶片上吸去水分，置于暗室，将混匀的发光液均匀点在膜上，发光分析。条带用同内参蛋白β-actin标准化，然后用ImageJ软件（NIH，美国）测量灰度值分析。2.3.4鬼笔环肽染色用鬼笔环肽染色F-actin。（1）将hFOB细胞以每孔1.2×104个细胞的密度接种于24孔板，度过24h让细胞贴壁后处理细胞。hFOB细胞随机分为4组：1.转染对照质粒；2.转染对照质粒且暴露于4mM褪黑素；3.转染Flag-Septin4质粒；4.转染Flag-Septin4质粒且暴露于4mM褪黑素，细胞转染48h且褪黑素处理42h。（2）细胞固定。处理后的细胞用PBS洗涤三次，用4%多聚甲醛在室温固定30 min。（3）细胞打孔。用PBS洗涤细胞3次后，用0.1%的TritonX-100为固定好的细胞增加通透性，打孔15min。（4）染色。根据说明书配置1×鬼笔环肽工作溶液。洗涤细胞3次，用工作液在避光、室温染色细胞30 min。细胞用PBS在摇床上洗涤3次，每次5min，以去除多余的鬼笔环肽。用DAPI在避光、室温进行细胞核染色30min，再用PBS洗涤细胞三次。最后，用荧光显微镜观察细胞并拍摄。2.3.5统计分析实验数据来自至少三个独立的实验，并利用GraphPadPrism5软件分析。采用9 中国医科大学硕士学位论文独立样本t检验或单因素方差分析（方差分析）对不同治疗组之间的数据差异进行评价。所有数据均表示为平均±标准偏差，P＜0.05被认为有统计学意义。3结果3.1高浓度褪黑素降低hFOB1.19细胞的活力，促进细胞凋亡为了确定高浓度褪黑素对hFOB1.19细胞活力的影响，同时也为了明确各个浓度梯度对成骨细胞活力的作用情况，我们首先使用MTT分析检测细胞活力。用0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h，如图1a所示，细胞存活率随着褪黑素的浓度的增加而降低。随后，我们用AnnexinV-FITC/PI双染色细胞，再用流式细胞术分析了高浓度梯度褪黑素作用成骨细胞诱导其凋亡的变化。图1b显示hFOB细胞凋亡的程度明显随着褪黑素浓度的提高而升高。10 中国医科大学硕士学位论文图1高浓度褪黑素抑制hFOB1.19细胞活力，促进细胞凋亡（A）0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h，MTT法检测细胞活力。高浓度褪黑素显著抑制成骨细胞活力，且呈剂量依赖关系。（B）流式细胞术分析显示高浓度褪黑素显著的促进了细胞的早期凋亡（Q4区域），且呈剂量依赖关系。结果与对照组相比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2高浓度褪黑素对Septin4表达的作用为了探究Septin4在骨代谢疾病中的意义，我们随后分析了高浓度褪黑素在hFOB细胞中对Septin4表达变化的影响。图2显示对Septin4的表达随着褪黑素浓度的升高而显著增加，然而值得主意的是，当褪黑素的刺激太强（6mM）的时候，它的表达明显减少。因此，我们的研究结果表明，Septin4在高浓度褪黑素介导hFOB细胞凋亡时，潜在发生了重要作用。图2高浓度褪黑素对Septin4的作用0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h，westernblot显示，与未处理的对照组相比，高浓度褪黑素（2mM，4mM和6mM）作用hFOB细胞48h显著增加Septin4表达，当褪黑素浓度为6mM时，Septin4的表达明显减少。结果与对照组相比较，***p<0.0013.3高浓度褪黑素增加ERS和凋亡通路相关基因的表达此外，我们还分析了高浓度褪黑素在hFOB细胞中对ERS（GRP78、GRP94）11 中国医科大学硕士学位论文和细胞凋亡（Caspase-3）途径相关基因的表达。图3显示GRP78、GRP94和Caspase-3的表达随着褪黑素浓度的升高而显著增加，高浓度褪黑素介导hFOB细胞内质网应激及凋亡，且程度与浓度正相关。图3高浓度褪黑素增加GRP78、GRP94和caspase-3的表达0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理hFOB细胞48h，westernblot显示与未处理的对照组相比，GRP78、GRP94和caspase-3蛋白的表达显著提高且呈剂量依赖性。结果与对照组相比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.4过表达Septin4加强高浓度褪黑素抑制hFOB细胞活力和促进细胞凋亡为了进一步地研究Septin4如何参与高浓度褪黑素诱导hFOB1.19细胞的损伤，同时也为了选择褪黑素适当的浓度，我们用Flag-Septin4质粒或空白对照质粒转染12 中国医科大学硕士学位论文hFOB细胞48h，用0mM，2mM，4mM和6mM的褪黑素作用hFOB细胞42h。图4a显示，与转染空白对照质粒的细胞相比，转染了Flag-Septin4质粒的细胞活力进一步被抑制，而且当褪黑素的浓度是4mM的时候，这一现象更为明显。所以我们选择4mM浓度的褪黑素作为最佳实验条件。随后，用AnnexinV-FITC/PI双染色细胞后，再用流式细胞术分析褪黑素诱导成骨细胞凋亡的情况，如图4b所示，与转染空白对照质粒的细胞相比，转染了Flag-Septin4质粒的细胞凋亡被显著提高。因此，研究结果提示，Septin4显著增强高浓度褪黑素抑制hFOB细胞活力和促进细胞凋亡的能力。图4Septin4显著加强高浓度褪黑素抑制hFOB细胞活力和促进细胞凋亡（A）0mM，2mM，4mM和6mM浓度的褪黑素处理转染Flag-Septin4质粒或空白对照质粒的hFOB细胞42h.MTT结果显示过表达Septin4进一步抑制hFOB细胞活性。（B）0mM和4mM浓度的褪黑素处理转染Flag-Septin4质粒或空白对照质粒的hFOB细胞42h，流式细胞术13 中国医科大学硕士学位论文分析表明，过表达Septin4加重了高浓度褪黑素诱导的细胞早期凋亡（Q4区）。结果与NC组相比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.5过表达Septin4增加高浓度褪黑素介导hFOB1.19细胞ERS和凋亡通路相关基因的表达此外，我们接着分析了过表达Septin4对高浓度褪黑素在hFOB1.19细胞中介导ERS和凋亡通路相关基因表达的影响。用Flag-Septin4质粒或空白对照质粒转染hFOB细胞48h，用0mM和4mM褪黑素作用hFOB细胞42h。如图5所示，与转染空白对照质粒的细胞相比，在转染了Flag-Septin4质粒的细胞中，ERS途径（GRP78、GRP94）和细胞凋亡（caspase-3）相关基因的表达皆有明显增加。因此，研究结果表明，Septin4在高浓度褪黑素诱导hFOB细胞ERS和凋亡中发挥了巨大作用。图5过表达Septin4加强高浓度褪黑素介导hFOB1.19细胞ERS和细胞凋亡通路相关基14 中国医科大学硕士学位论文因的表达0mM和4mM浓度的褪黑素处理转染Flag-Septin4质粒或空白对照质粒的hFOB细胞42h，Westernblot分析表明，1.与转染空白对照质粒的细胞相比，在转染了Flag-Septin4质粒的细胞中，Flag及Septin4的表达显著增强，说明成功建立了有效的Septin4过表达。2.高浓度褪黑素作用hFOB后，GRP78、GRP94和Caspase-3蛋白在过表达Septin4的细胞中表达显著增加。结果与NC组相比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.6过表达Septin4增强高浓度褪黑素诱导hFOB1.19细胞细胞骨架的破坏以及细胞形态学变化的程度为了确定高浓度褪黑素是否能导致细胞骨架的破坏，我们应用鬼笔环肽染色纤维状肌动蛋白（F-actin），用DAPI进行细胞核染色，随后应用荧光显微镜进行分析。图6表明，在未用褪黑素处理组，肌动蛋白是沿着hFOB细胞的轴线排列，形态有序，细胞形态规则呈梭形。当细胞暴露于4mM褪黑素42h后，肌动蛋白微丝变得排列无序、模糊甚至被破坏，此外，细胞的形状变大且不规则呈多角形，同时细胞数目也明显减少。统计分析表明，与转染空白对照质粒的细胞相比，这种情况在过表达Septin4的细胞中加剧了。因此，研究结果表明，过表达Septin4增加高浓度褪黑素诱导hFOB1.19细胞细胞骨架的破坏。15 中国医科大学硕士学位论文图6过表达Septin4增加高浓度褪黑素对hFOB胞细骨架的破坏（A）0mM和4mM浓度的褪黑素处理转染Flag-Septin4质粒或空白对照质粒的hFOB细胞42h，F-actin用鬼笔环肽染色，DAPI进行细胞核染色标记。然后每组将这两张照片融合。16 中国医科大学硕士学位论文荧光显微镜观察结果显示，与对照组相比，高浓度褪黑素作用后，过表达Septin4的细胞形态不规则、数量减少以及细胞骨架的破坏都加剧了。（B）为图片的局部放大，黄色箭头所示可见尚存在的F-actin细胞骨架；红色箭头所示细胞骨架被破坏。柱状图显示为细胞骨架被破坏的细胞占总细胞的百分比，结果与NC组相比较，**p<0.01。4讨论寻找特发性脊柱侧凸的发病机制，以及针对性做出有效的预防和诊疗仍然是脊柱矫形医生的难题[49]，在未来药物治疗可能作为手术治疗特发性脊柱侧凸的辅助手段。研究表明特发性脊柱侧凸进展情况与患者生长发育时期相对应，疾病进展最快出现在骨骼快速发育、成骨细胞增殖最活跃的时间段[12]，而且经证实，褪黑素水平与特发性脊柱侧凸有密切联系[18]，这可能与褪黑素调控成骨细胞的增殖或凋亡有关。在之前的研究中，我们证实褪黑素对成骨细胞增殖发挥剂量依赖性效应，低浓度褪黑素促进成骨细胞增殖，而高浓度褪黑素显著抑制成骨细胞活力[21,22]。这些发现提示了褪黑素在预防和逆转特发性脊柱侧凸进展中可能的临床应用。在既往的研究中，大量证据表明低浓度褪黑素通过促进成骨的方式调节骨代谢，其主要应用于增加骨重塑、促进骨折或骨缺损的修复和对抗骨质疏松方面[7]。然而在高浓度褪黑素介导成骨细胞凋亡，尤其是治疗特发性脊柱侧凸方面则鲜有报道。我们希望通过研究证明是否可以应用高浓度褪黑素诱导成骨细胞增殖抑制或凋亡来缓解、减轻脊柱侧凸的进展，因此我们研究了高浓度褪黑素引起成骨细胞ERS和细胞凋亡的机制。在本研究中我们果然发现了高浓度褪黑素促进成骨细胞凋亡，并且在这个药物作用过程当中，我们发现了Septin4蛋白表达的变化。这说明在这个诱导过程中，Septin4参与并且发挥了重要作用。所以我们的研究得出结论：高浓度褪黑素导致成骨细胞凋亡是通过Septin4完成这一进程。我们的研究首次提出高浓度褪黑素通过调控Septin4介导hFOB1.19细胞ERS和细胞凋亡,甚至第一次提出Setpin4参与骨代谢疾病。我们的研究结果发现Setpin4的表达水平在高浓度褪黑素介导人成骨细胞凋亡中显著增加，有趣的是，当褪黑素的刺激太强（6mM）的时候，Septin4的表达反而明显减少。这种情况与其他学者在应用脂多糖（LPS）诱导人肝星形细胞（LX-2细胞）中Septin4表达的变化趋势类似[41]。由于Septin4作为细胞骨架广泛存在于大多数真核生物细胞中，我们考虑这种情况的发生可能是由于外界刺激过强，导致成骨细胞的细胞骨架破坏过于严重，17 中国医科大学硕士学位论文蛋白崩解所致。为了进一步明确Septin4在高浓度褪黑素诱导成骨细胞损伤模型中的作用，我们进行了转染过表达Setpin4，结果发现其诱导的成骨细胞损伤进一步加剧，具体体现为细胞活力进一步降低，细胞凋亡加重、内质网应激（GRP78、GRP94）及凋亡（Caspase-3）相关通路蛋白的表达都有显著的增高。此外，为了探索Septin4参与高浓度褪黑素与细胞骨架破坏的相关性，我们应用鬼笔环肽染色纤维状肌动蛋白，DAPI染色标记细胞核，结果发现细胞骨架的破坏，细胞形态学的改变以及细胞数量的减少这些情况都在成骨细胞过表达Septin4后加重了。因此我们的研究结果意味着Septin4蛋白在参与高浓度褪黑素介导人成骨细胞内质网应激以及细胞凋亡中发挥着重要作用，这可能为治疗骨代谢疾病比如特发性脊柱侧凸提供新的思路和视野。Setpin4，作为具有GTP酶的活性Septins家族的一个亚型，是细胞骨架的基本组成部分，其具有多种剪接变体[50]。PNUTL2和ARTS是Setpin4的两种主要蛋白质同种型。ARTS被认为是参与TGF-β信号通路诱导细胞凋亡的关键性分子之一,是一种白血病抑癌基因[51]。Elhasid指出Septin4(ARTS)是通过特异性拮抗XIAP促进细胞凋亡的肿瘤抑制蛋白[52]。ARTS中的P-loopGTPase域的重要性不仅在于其维持其核心结构，也在于他能够和其他的凋亡信号蛋白相互作用[50]，然而，Septin4能与哪些凋亡信号蛋白互相作用我们不甚了解。有学者报道Septin4可通过调节肝癌细胞的细胞凋亡抑制肝癌[53]，还有学者报道Septin4可通过细胞凋亡途径减弱由日本血吸虫诱导的肝纤维化进程发展[44]。一些研究表明Septin4（ARTS）可加重由TGF-β，依托泊苷和星形孢菌素诱导的细胞死亡，Septin4参与由CCl4和BDL引起抑制肌纤维母细胞转化和肝纤维化的调节[54]。而我们是首次发现Septin4通过细胞凋亡途径调节骨代谢。我们的研究为治疗成骨细胞异常增殖的疾病提供了新的方向，然而我们存在不足之处。我们首先在骨代谢疾病中提出Septin4的促进凋亡作用，但是在其他骨科疾病比如针对骨肿瘤的作用尚未揭示。我们首次报道Septin4在成骨细胞中导致凋亡，但是Septin4能与哪写凋亡信号蛋白共同作用我们不得而知，褪黑素调控Septin4促进成骨细胞凋亡、延缓脊柱侧凸进展尚需动物疾病模型上继续验证，我们将会在后续的研究中继续探究解析。18 中国医科大学硕士学位论文5结论本研究证实Septin4参与并增强了由高浓度褪黑素介导的人成骨细胞内质网应激和细胞凋亡过程，加重高浓度褪黑素对成骨细胞细胞骨架的破坏以及细胞形态学变化的程度。19 中国医科大学硕士学位论文本研究创新性的自我评价我们的研究首次提出Setpin4参与并增强高浓度褪黑素介导hFOB1.19细胞ERS和细胞凋亡，提示Setpin4参与骨代谢疾病，推测其可能为治疗特发性脊柱侧凸的新机制，为治疗成骨细胞异常增殖的疾病提供了新的方向。20 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中国医科大学硕士学位论文综述内质网应激的研究进展[摘要]细胞内参与调节细胞进程重要的细胞器：内质网(endoplasmicreticulum，ER)，它同时也作为重要的钙离子贮存场所而存在。内质网有几个重要的功能，例如蛋白的合成、折叠、分泌和转译后修饰等，它参与调节细胞对外界应激的反应，还有细胞内钙水平变化和胆固醇的合成[1]。外界刺激导致细胞内质网生理功能发生紊乱，引起钙稳态失衡、钙超载，这将导致钙稳态的失衡。这种变化将引发错误折叠或者未折叠的蛋白质聚集在内质网腔中，称为内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS)[2,3]。内质网应激包括二硫键结合减少、突变蛋白质表达、钙离子从内质网腔排空、糖基化抑制等一系列的病理生理过程。任何有害条件下内质网应激会导致降低蛋白合成，增加分子伴侣的表达,促进蛋白质的正确折叠和细胞复苏[4]，内质网减轻细胞损伤的途径主要通过激活未折叠蛋白反应（UPR）[5]，甚至进而回复细胞功能。然而，过强或长时间的ERS，可引起细胞凋亡[6-8]。[关键词]:内质网应激凋亡疾病内质网应激诱导的生存途径未折叠蛋白反应是由分子伴侣和3个感受蛋白介导的，内质网分子伴侣是GRP78/BIP,另外三个感受蛋白是PERK、IRE-1和ATF6。当无外界刺激或外界刺激程度不强时，PERK、ATF6、IRE-l与GRP78处于结合状态，此时他们并无活性。然而当外界刺激程度增强导致产生ERS时，GRP78与3种跨膜蛋白解离，转而去结合堆积产生的未折叠蛋白。感受蛋白此时被活化，激活未折叠蛋白反应，减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累，这一过程可逐渐恢复内质网的正常功能，所以说，这是内质网应激诱导的生存途径[1,9-12]。内质网应激诱导的凋亡途径上述三种感受蛋白不仅能够启动ERS的生存途径，当外界刺激程度过于严重或者刺激时间过长以至于破坏了内质网的功能时，PERK、IRE-1和ATF6信号通路将继续启动由内质网应激诱导的细胞凋亡途径。这一过程导致的结果就是：损伤过重的细胞因被诱导凋亡而死去，然后对于整体器官甚至生物来讲，将得到保护。这三个感受蛋白并非直接引起细胞凋亡的，他们需要通过激活下游的凋亡信号分子，如26 中国医科大学硕士学位论文CHOP、JNK、caspase-12以及Bcl-2家族等等。Caspase-12被证实为参与且唯一参与内质网应激导致细胞凋亡的关键因子。其处于内质网外膜，在非内质网应激引起凋亡的途径中不发生变化。研究表明，Caspase-12基因缺陷鼠可以抵抗由内质网应激途径导致的凋亡途径，但是对于其他途径如线粒体凋亡途径引起的凋亡，并无明显抵抗力，以上证据表明caspase-12仅与ERS介导凋亡的途径有关，并且和非内质网应激介导的凋亡不发生关系。简而言之，Caspase-12仅作为内质网凋亡途径的唯一下游蛋白而存在。Caspase-12和其家族其他的caspase一样，保持以无活性的酶原形式。过强的外界刺激导致ERS，进而激活caspase-12，cleaved-caspase-12随即激活caspase-9，一系列的反应最终激活caspase-3这一凋亡途径的总蛋白，最终导致细胞凋亡。Caspase-12不依赖Cytochrome[9，13]C或Apaf-1这些线粒体凋亡途径蛋白对下游蛋白进行激活。内质网应激参与了多种疾病进程，与他们都是牢不可分的。这主要因为内质网应激可以通过调控细胞凋亡来影响许多疾病的进程。如一些神经系统变性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、骨科疾病、肿瘤等。内质网应激与于阿尔茨海默病阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD)又叫做老年痴呆，占痴呆患者近80%，[14、15]是最常见的痴呆类型。其病理特征性病理表现为：细胞外β-淀粉样蛋白沉积和细胞内微管关联蛋白高度磷酸化导致的神经纤维化缠结。其镜下病理改变可见大量神经元和突触丢失。有研究显示，家族阿尔茨海默病(FAD)与淀粉样蛋白前体基因、早老因子-1(presenil-1，PS1)基因、早老因子-2基因的突变有关[16]。PS1是作为与AD有关的关键因子，是一种跨膜蛋白质且主要存在于ER，其基因的突变使细胞对各种外界刺激诱导的细胞损伤的敏感性加强。由于GRP78mRNA的诱导，PS1突变型人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞的表达增加了细胞对衣霉素或钙离子载体诱导的内质网应激反应的敏感性。有证据表明，FAD相关PS1突变体可能通过抑制IRE-1和ATF6而阻止UPR的激活，还可干扰PERK的激活，表明PS1突变体可影响正常细胞对内质网应激的反应，从而影响FAD的发生。也有文献报道针对以上机制应用白藜芦醇衍生物预防和/或治疗如阿尔茨海默病这些神经退行性疾病[17-21]。不仅在阿尔茨海默氏症，越来越多的证据表明，ERS可能在其他一些急性和慢性神经退行性疾病中的发病机制中发挥重要作用，如脑出血、帕金森病、朊病毒疾病以27 中国医科大学硕士学位论文及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等[22-24]。内质网应激与糖尿病及心血管疾病糖尿病(DM)特征是由于胰岛素分泌缺陷导致的高血糖症，且常伴有高脂血症。如果细胞遭受不利的条件,包括过多的葡萄糖、感染、缺氧、缺血或血管紧张素II的刺激,ER的体内平衡破坏,导致多个展开或错误折叠蛋白质的积累，这导致随后的UPR及ERS[25]。如果持续的高血糖,ERS是长期的,当细胞不能解除应激，他们讲导致细胞凋亡[26]。Caspase通路也通常导致ERS,尤其是caspase-12,虽然确切的机制还有待阐明。已经有报告指出心脏疾病中由ERS导致的重要机制，ERS参与各种心血管疾病的发病机制,包括冠心病、心肌缺血再灌注损伤、心肌病和心力衰竭[27-30]。内质网应激与骨科疾病内质网应激同样在骨细胞的生长、凋亡及相关骨病中，发挥着重要的调节作用。骨髓间充质干细胞可以分化成多种细胞系并且可以产生一个或多个定向祖细胞。ERS可以影响并增强其向成骨细胞分化的能力[31]。由于不同强度的外界刺激产生不同强度的ERS,导致其对成骨细胞有双向调节作用，ERS通过ATF4／CHOP信号通路影响并增强成骨细胞的分化和生长能力[32]。有学者发现，当ERS被抑制后，破骨细胞的增殖受到明显抑制[33]，ERS通过细胞白介素介导RANKL途径调控破骨细胞的增殖分化。因此，探究成骨/破骨细胞协调增殖分化的分子机制尤其重要，这将会对治疗骨相关疾病尤其是骨代谢疾病起到重要作用。软骨组织是结缔组织的一种，在机体中起到支撑、缓冲、减少关节面阻力作用。ERS影响正常软骨细胞的分化，然而过强的外界刺激引发ERS，会导致软骨发育异常。ERS还可介导软骨细胞凋亡，加速软骨退变进程，研究发现在这些过程中，CHOP、BMP2等因子表达量明显提高[34]。骨质疏松症（osteoporosis）是由于多种原因导致的单位体积骨量减少（骨密度和骨质量下降），造成骨脆性增加，从而极易发生骨折的全身性骨代谢疾病。有学者对成骨细胞行氧化应激造模，检测ERS标记蛋白、成骨细胞活力以及成骨细胞凋亡情况。结果发现活性氧通过内质网应激途径对成骨细胞的影响存在双向调节：低浓度促进成骨细胞增殖，反之诱导成骨细胞凋亡[35]。地方性氟中毒，是由于长期摄入过量氟元素而引发的一种慢性全身性疾病，可表现为氟骨症和氟斑牙，导致慢性骨代谢疾病。最近研究发现，氟元素通过ERS途径对成骨细胞也存在双向调节：低浓度的氟剂刺激成骨细胞增殖，但高剂量氟的细胞毒性作用会通过ERS途径诱导成骨细胞凋亡[36]。成骨不全(OsteogenesisImperfecta，OI)是一种是一种少见的先28 中国医科大学硕士学位论文天性骨骼发育障碍性疾病，又称脆骨病，也是结缔组织异常遗传病。患者骨骼发育障碍是由基因突变导致的。病理特征为造成胶原形成障碍和骨纤维结构异常。异常胶原蛋白大量堆积在内质网中，作为强力外界刺激导致ERS和细胞自噬，ERS通过内质网相关蛋白降解途径和内质网自噬参与疾病，降解异常的胶原分子和前胶原蛋白[37]。内质网应激与肿瘤的治疗有文献报道，应用依地福新治疗尤文肉瘤，使其在内质网积累，触发ERS，,最终导致Caspase激活肿瘤细胞凋亡[38,39]。此外，还有研究应用三硝基甲苯在人原发性肝癌细胞（HePG2）中诱导内质网应激和凋亡[40]。结语内质网应激在各种疾病中的具体的分子机制还不够完善，需要加强，未来是否可以通过寻找ERS在各种疾病中作用机制的靶点,进而为我们在治疗疾病中提供新的视角，这是我们未来的研究方向。参考文献[1]SalminenAntero,KauppinenAnu,etal.ERstressinAlzheimer'sdisease:anovelneuronaltriggerforinflammationandAlzheimer'spathology[J].Journalofeuroinflammation.20096:41.[2]ZhangK,KaufmanRJ.Fromendoplasmic-reticulumstresstotheinflammatoryresponse[J].Nature.2008,454(7203):455-62.[3]KawaguchiS,NgDT.Cellbiology.SensingERstress.Science.2011,333(6051):1830-1831.[4]MatusS,GlimcherLH,HetzC.Proteinfoldingstressinneurodegenerativediseases:aglimpseintotheER[J].CurrOpinCellBiol.201123:239–252.[5]MartinSchröder.TheUnfoldedProteinResponse[J].MolBiotechnol,2006,34(2):279-290.[6]LindholmD,WootzH,KorhonenL.ERstressandneurodegenerativediseases[J].CellDeathDiffer.200613:385–392.[7]ChenG1,GongM,YanM,etal.Sevofluraneinducesendoplasmicreticulumstressmediatedapoptosisinhippocampalneuronsofagingrats[J].PLOSOne.2013,8(2):e57870.[8]CrespoI,San-MiguelB,PrauseC,etal.GlutaminetreatmentattenuatesendoplasmicreticulumstressandapoptosisinTNBS-inducedcolitis[J].PLOSOne.2012,7(11):e50407.29 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中国医科大学硕士学位论文致谢时光荏苒，转眼间三年研究生生涯悄然间就接近尾声了，回想读研期间的点点滴滴，百感交集。在此谨向所有关心、支持和帮助我的师长、同学和亲友呈上我最衷心的感谢与最美好的祝愿。本论文是在我的导师朱悦教授的悉心指导下完成的。整体课题的设计和实验思路都凝聚着老师的精力和心血，尤其是对科研思维的培养为我走向科研道路奠定了坚实的基础。朱老师渊博的学识、严谨的治学作风、新颖的学术观点和实事求是的工作作风使我终生受益。您对我的谆谆教导将对我人格塑造产生深远影响，并将激励我在今后的学术道路上不断进取，在此，对老师精心的培养和辛勤的劳动致以最诚挚的敬意和最衷心的感谢！感谢中国医科大学和中国医科大学附属第一医院的全体老师和同学对我学习生活的关心和帮助，感谢师兄弟陶琳、孟小童、邱水和实验室同学孙大壮、杨博、许振斌、刘永一、蔡振煜对我学习工作中的指导与帮助，感谢张乃今、田羽、李振航、梁海洋、熊朔、刘强在学习与生活上对我的支持和爱护，感谢周仁义、丛琳、李杰、夏茂盛、梁栋、裴磊等老师给予我在工作上的帮助和关心，感谢身边所有的同学和朋友对我的关心和包容！同时还要对在百忙之中抽出时间评阅论文的专家、学者表示诚挚的谢意！最后，我要感谢一直在身后默默支持和关心我的家人们，你们对我的支持和关心是我努力前行的动力和坚强的后盾。赵思超2018年2月33 中国医科大学硕士学位论文个人简历姓名：赵思超性别：男民族：汉族学习经历：2008年9月—2013年7月中国医科大学大学临床医学专业本科2013年7月—2015年7月辽化总医院外科工作2015年9月—2018年7月中国医科大学第一临床学院外科学专业硕士研究生34