β-羟丁酸抑制淀粉β样蛋白介导的神经细胞氧化应激和凋亡的机制研究

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1、β-羟丁酸抑制淀粉β样蛋白介导的神经细胞氧化应激和凋亡的机制研究Themolecularmechanismsofβ-hydroxybutyrateprotectingagainstamyloid-betapeptide-mediatedapoptoticandoxidativestressonneurons作者姓名：田武林专业名称：临床兽医学指导教师：谢光洪副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月5日本研究受国家自然基金项目(31101865)资助ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationfun

2、ded(31101865)中文摘要β-羟丁酸抑制淀粉β样蛋白介导的神经细胞氧化应激和凋亡的机制研究β-羟丁酸（β-HB）是一个内源性的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂，它可以通过调节Foxo3a和Mt2，起到抗氧化作用；此外，体外实验也验证了β-HB能够保护双氧水造成的氧化性损伤，说明β-HB具有抗氧化作用。淀粉样β蛋白（amyloid-betapeptide，Aβ）在大脑内的聚集和沉淀能够造成神经细胞产生ROS，使细胞发生氧化应激和凋亡。Aβ对神经细胞的氧化性损伤被认为是阿尔兹海默病（Alzheimer'sdisease，AD）发病机制中的重要一环。目前，关于β-

3、HB对Aβ造成的氧化应激和细胞凋亡是否有作用的相关研究未见报告。因此本研究以Aβ诱导的神经细胞损伤（PC12细胞）体外模型和Aβ海马内注射建立大鼠AD氧化凋亡模型，同时给予外源性β-HB进行保护性治疗进行相关机制研究。为了验证β-HB是否具有保护效果，我们对PC12细胞进行了MTT活力分析和细胞凋亡分析（AO/EB染色和AnnexinV/PI双染色）。1mM-4mM的β-HB可以明显地抑制Aβ引起的PC12细胞死亡，并且保护效果成剂量依赖性。β-HB保护组的细胞凋亡率显著低于Aβ刺激组，这表明β-HB能够抑制Aβ引起的氧化凋亡。为了进一步探索β-HB的保护机制，我们检测

4、多个氧化指标和抗氧化指标，2+包括MDA含量，抗氧化酶(SOD、CAT)活力和相应基因表达的变化，ROS和Ca浓度以及Nrf2核内水平。体外实验结果显示，β-HB预处理可以明显地减少Aβ诱导的ROS产生、胞内钙超载和脂质过氧化，上调Nrf2表达，CAT和MnSOD的基因表达和酶活力，从而阻止了Aβ引起的细胞抗氧化能力下降。结果说明β-HB能够增强细胞的抗氧化能力。接下来，我们检测了凋亡相关蛋白caspase-12、9、3，AIF，EndoG，Bax，Bcl-2，P53的变化情况。体外实验结果表明，β-HB显著地抑制了Aβ诱导的caspase-12、9、3的活化，AIF、

5、EndoG的释放和EndoG的入核，Bax表达上调和Bcl-2表达下调，以及p53磷酸化。说明β-HB抑制Aβ介导的凋亡蛋白活化。I体外实验发现β-HB能够保护Aβ介导PC12细胞氧化凋亡，为了进一步验证β-HB的保护效果，我们以Aβ海马内注射建立大鼠AD氧化凋亡模型为研究对象观察β-HB的保护效果。病理组织学检查和TUNEL凋亡分析显示，在Aβ模型组，海马组织内呈现出核仁模糊不清、胞核与胞浆界限不清、细胞排列无序等现象以及凋亡神经元数量增多；而β-HB预处理有效地改善了海马组织损伤和抑制了神经元凋亡。MDA含量和抗氧化酶（SOD、CAT）活力检测显示与体外实验结果一致

6、。凋亡相关蛋白caspase-12、9、3，AIF，EndoG，Bax，Bcl-2，P53结果与体外实验一致。综合体内实验和体外实验的结果，可以确认β-HB能够调节Nrf2提高神经细胞的抗氧化能力，通过内质网和线粒体凋亡途径，抑制Aβ介导的海马组织和PC12细胞氧化应激和细胞凋亡。本研究为β-HB的神经保护作用和AD的防治提供了理论依据。关键词：β-HB；Aβ：细胞凋亡；氧化应激；AD；神经保护IIABSTRACTThemolecularmechanismsofβ-hydroxybutyrateprotectingagainstamyloid-betapeptide-m

7、ediatedapoptoticandoxidativestressonneuronsAsanendogenoushistonedeacetylase(HDAC)inhibitor,β-HBcansuppressoxidativestressbypromotingthehistoneacetylationofFOXO3AandMT2atthepromoters,whicharetwogenesencodingoxidativestressresistancefactors.Inaddition,β-HBwasprovedtobeprote