干预β淀粉样前体蛋白裂解酶基因减少神经细胞β淀粉样蛋白的产生

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1、山东大学博士学位论文干预B一淀粉样前体蛋白裂解酶基因减少神经细胞B淀粉样蛋白的产生专业内科(心血管病学)博士研究生高素琴博士生导师韩恩吉教授中文摘要研究背景随着人类平均寿命的不断延长，阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)越来越成为影响老年人生活的一大疾病。在国外阿尔茨海默病是导致老年人智能损害的最常见原因，超过65岁的人群中有大约5-10％的人患有阿尔茨海默病，而85岁以上的老年人有超过一半的人患有阿尔茨海默病。在国内，我们一度认为血管性痴呆的发病率高于AD，但是最近几年的流行病

2、学调查显示，AD在我国的发病率也处于各种痴呆的第一位。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性变性疾病。患者由于神经细胞的大量死亡而逐渐出现记忆能力、语言能力和直觉能力的全面下降，最终会因脑衰竭而死亡。阿尔茨海默病最具有特异性的病理特征的是老年斑、神经纤维缠结，以及神经突触和神经细胞的丢失。而脑组织内老年斑的形成是造成阿尔茨海默病的主要原因，而且在阿尔茨海默病的早期出现。老年斑的主要成分是39—43氨基酸长的p淀粉样肽(p—amyloidpeptide，Ap)，Ap由D淀粉样前体蛋白(p—amyloidp

3、recursorprotein，APP)水解而来，APP可以被三种水解酶裂解：a．secretase、13-secretase、y-secretase。a—secretase的水解位点在APP跨膜区的Ap区内，产生一长的可溶性的胞外结构仅．APPs和一83碱基的C末端(COOH-terminalfragment，CTF)q83，不产生A13。而淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)经B淀粉样前体蛋白裂解酶(13-site山东大学博士学位论文APPcleavingenz

4、yme，BACEl)和丫一分泌酶裂解产生AD。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分p一淀粉样肽(13-amyloidpeptide，Ap)是AD发生的主要原因。BACEl(13-secretase)酶是A13形成的关键酶。老年斑或AD可以促进AD的疾病进展，而且是AD临床表现的关键性因素。AD具有神经毒性作用，当Ap在脑组织中沉积超过一定的时间后，就可以造成神经细胞的死亡、脑内的炎症性反应、以及其他的可以促进AD病情进展的有害的病理改变。而且，大量的研究显示，Ap在AD患者疾病的早期即出现。小干扰I斟A(

5、siRNA)可谓是引起生物科学研究领域一场变革的工具，siRNA是一种特异性抑制特定基因的有力手段。RNAi不但可以用来快速的判断基因的功能，而且目前已经在病毒感染、肿瘤和遗传性疾病中进行了大量的研究，并取得了良好的效果。减少AB的生成成为治疗AD的主要靶位点。目前唯一得到FAD许可的治疗药物只有乙酰胆碱酯酶抑制剂(如tacrine，donepezil，rivastigmine，galantamine)，而其他的药物治疗正在研究进行中，这些包括：单胺氧化酶抑制剂(如selegiline)，抗氧化剂(如

6、VitE、C)，雌激素替代疗法和抗炎制剂(如非甾体类抗炎药物)，大多数的治疗均为姑息性治疗，而非预防或治愈性手段。目前减少Ap产生的有许多方法，在本实验中我们选择了抑制BACEl基因作为研究的靶基因，通过抑制此该基因的表达来减少AD的生成。我们利用干扰技术应用siRNA对BACEl基因进行干扰抑制，观察BACEl基因在SK-N—SH细胞株中的表达的改变，以及AD产生的改变情况。研究目的1、利用siRNA干扰技术，采用化学合成的siRNA干扰或封闭BACEl基因，观察BACEl的表达改变。2、进一步观察

7、BACEl基因的表达下降后，对体外培养的神经细胞Ap产生的影响。2实验方法1、人类的神经母细胞瘤细胞SK．N．SH细胞正常情况下，表达APP和山东大学博士学位论文BACEl，我们利用SK-N．SH细胞作为体外研究的细胞系。2、我们利用Ambion公司的Silencer@pre．designedsiRANSpecificationsystem设计合成了3对BACEl基因双链siRNA。3对siRNAs特异性的针对BACEl基因。3、利用Ambion公司的siPORTNeoFX转染试剂转染siRNA入SK

8、-N．SH细胞。为比较、观察siRNA对BACEl基因的干扰作用，分别使用了10uM．50uM浓度不等的siRNA转染SK-N．SH细胞，并且分别从12-48小时搜集细胞，进行检测。4、应用RT-PCR在的mRNA水平上检测BACEl基因的表达。5、应用Westemblot方法，检测转染48小时后的神经细胞的BACEl蛋白表达。6、应用酶联免疫吸附测定(enzyme．1inkedimmunosorbentassay,ELISA)检测分泌到细胞外的A134