绵羊kisspeptin介导的gnrh基因表达调控机制的研究

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1、分类号：密级：学号：2012108001单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊kisspeptin介导的GnRH基因表达调控机制的研究学位申请人郭若婷指导教师刘小军教授申请学位类别农学硕士专业名称动物遗传育种与繁殖研究领域动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年5月GeneticMechanismsMediatingKisspeptinRegulationofGnRHgeneExpressioninSheepADissertationSubmittedtoShiheziUniversityIn

2、PartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByGuoRuo-ting(AnimalGeneticsBreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Prof.LiuXiaojunMay,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研

3、究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：2015年5月30日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：2015年5月30日导师签名：时间：2015年5月30日摘要遗传学的研究表明，KISS-1和Gn

4、RH是控制包括绵羊在内的动物发情的关键基因。虽然已知绵羊GnRH的表达受kisspeptin的调控，但具体的分子机理尚不清楚。本研究以季节性繁殖的阿勒泰绵羊为实验动物，利用双荧光素酶报告系统、RT-PCR和实时荧光定量PCR技术，并结合生物信息学分析手段，对绵羊kisspeptin介导的GnRH基因表达调控的机制进行了研究。首先，利用胚胎日龄为55~90天的绵羊胚胎下丘脑组织，成功建立了原代绵羊下丘脑神经细胞培养体系，体外培养的胎羊下丘脑细胞保留了在体内下丘脑神经元的形态和功能特征；然后，成功克隆了绵羊GnRH基因启动子区-2313b

5、p~+173bp不同长度的片段，并构建了荧光素酶报告基因重组载体pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、pGL3-8；第三，通过双荧光素酶报告系统检测发现，pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、pGL3-8与空载体pGL3-Basic相比有明显的活性（P<0.05），其中pGL3-1、pGL3-3、pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、pGL3-8载体的表达活性较为相似（P>0.05），而pGL3-2

6、载体的表达活性极显著高于空载体及其他载体（P<0.05），进一步的生物信息学分析表明，绵羊GnRH启动子区存在有转录因子Otx-2的结合位点；最后，运用RT-PCR和荧光实时定量PCR技术，对KISS-1及Otx-2、GnRH、MT1基因的组织表达谱进行了研究，并从细胞和个体水平证明kisspeptin通过Otx-2对GnRH基因的表达进行调控。综合以上试验结果，得出如下结论：绵羊GnRH基因核心启动子位于-1843bp~-1503bp大约300bp的区域内，而在-2313bp~-1843bp的区域内可能有负转录调控元件存在；转录因子

7、Otx-2可结合于GnRH启动子-1508bp~-1503bp位点，kisspeptin可能通过Otx-2调控GnRH基因的表达。关键词：绵羊；季节性繁殖；GnRH基因；载体构建；双荧光素酶报告基因；启动子；原代神经细胞培养IAbstractGeneticsstudyshows,KISS-1andGnRHgenesarethekeygenestocontroltheseasonaloestrusofseasonalbreedinganimals,includingsheep.Althoughwehaveknownthatkisspep

8、tinregulatedexpressionofGnRHinsheep,thespecificmolecularmechanismisunclear.Thereforewelookedintothekeyregionof