抗凋亡蛋白bcl-2在自噬调控以及细胞生存中的机制研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果·除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：刍笨净泰日期：塑12二!：翌苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，IZp,学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献

2、信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年—一月解密后适用本规定。非涉密论文凹论文作者签名．互笨珞．季日导师签名：粹日期：丝!三二生二!抗凋亡蛋白Bcl．2在自噬调控以及细胞生存中的机制研究中文摘要目的：抗凋亡蛋白Bcl．2在急性饥饿时，通过与自噬关键蛋白Beclinl的相互作用，抑制Beclinl诱导的自噬，但是在某些情况下，Bcl．2的过表达

3、并不能抑制自噬活性，因此抗凋亡蛋白Bcl．2和自噬之间的关系有待进一步研究。本研究的目的是探讨抗凋亡蛋白Bcl．2在自噬调控中的作用及其在细胞生存和死亡中的意义。方法：利用血清饥饿和自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin)在人神经母细胞瘤SH．SY5Y中，激活自噬，Westem检测自噬相关蛋白Beclinl，LC3，p62和CathepsinD，确定自噬激活模型成功；检测Bcl-2家族蛋白变化；利用siRNAKnockdownBcl．2，或者应用Bcl．2的小分子抑制剂拮抗Bcl．2的功能，用MTT法检测细胞在饥饿下的活力变化，用Annexin．V／PI检测细胞凋亡的改变；加入自噬

4、不同阶段的抑制剂，3-MA，E64D和BafilomycinAl，检测在Bcl．2被下调或被小分子抑制剂拮抗时，血清饥饿诱导的自噬对细胞活力的影响。结果：利用血清饥饿SH．SY5Y细胞6，12，24，36，48小时，Western检测自噬蛋白Beclinl，LC3，CathepsinD和p62，结果显示Beclinl，LC3和CathepsinD在血清饥饿时均上调，而自噬底物p62在6小时一过性下调，提示自噬被激活；用自噬激动剂雷帕霉素同样激活了自噬；在自噬被激活时，检测到抗凋亡蛋白Bcl．2上调；用si对妊干扰Bcl-2蛋白表达水平，检测到LC3无变化，加入溶酶体抑制剂氯化铵，L

5、C3出现堆积，并且自噬底物p62被进一步降解，提示自噬流量进一步增强；在Bcl．2被下调时，或者应用小分子抑制剂HA14．1和ABT-737拮抗Bcl．2的功能活性时，MTT结果显示，血清饥饿进一步使细胞活力下降，AnnexinV／PI结果显示细胞发生早期和晚期凋亡；泛caspase抑制剂Z．VAD阻断细胞死亡证实部分细胞死亡是凋亡性的：应用自噬不同阶段的抑制剂，E64D和巴普洛霉素(BafilomycinA1)抑制自噬，可以挽救血清饥饿导致的部分细胞死亡。这些结果表明，伴随自噬激活而上调的Bcl．2蛋白能够限制自噬的过度激活和保护营养应激中文摘要抗凋亡蛋白BcI一2在自噬调控以及

6、细胞生存中的机制研究下的细胞死亡，当Bcl．2被下调时，自噬进一步激活，并且细胞发生死亡，这种死亡是凋亡性的，同时又是自噬性，因为caspase的抑制剂和自噬的抑制剂都能够挽救部分细胞死亡。结论：营养剥夺诱导的自噬激活在生理条件下是保护性的，当Bcl．2下调时，抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白，抗自噬蛋白与促自噬蛋白之间的力量对比发生变化，这时候，上调自噬活性可以导致营养应激条件下的细胞死亡，提示自噬的保护性作用依赖于抗凋亡蛋白Bcl-2，一旦Bcl．2下调或者功能受损，自噬的激活对细胞死亡有贡献。关键词：Bcl．2：自噬；细胞死亡；营养剥夺II作者：徐海东导师：梁中琴教授秦正红教授T—h—

7、eroleofBcl·2inregulatingautophagyactivityandcellsurvivalduringstarvationAbstractTheroleofBcl·-2inregulatingautophagyactivityandcell●SUrvlValduringstarvatlonAbstractAims：Anti·-apoptoticproteinBcl--2couldinhibitessentialautophagicproteinB