牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的表达及ELISA诊断方法的建立

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摘要牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV）可引起牛发生急性、热性、接触性传染病--牛传染性鼻气管炎（Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR）。主要表现为呼吸道和生殖道感染。IBRV主要的基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因，其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面，能诱导机体产生保护性抗体的抗原，因此gD可作为鉴别诊断IBR的首选特异性抗原。本试验以IBRV的gD基因为研究对象，通过原核表达蛋白后，用其建立检测IBRV抗体的间接ELISA诊断方法，并进行初步应用，目的是期望在临床实践中能够快速检测和诊断牛传染性鼻气管炎病，为今后该病的检验检疫和净化提供技术支持。本研究主要进行了如下两个方面的研究工作：一、IBRVgD基因的原核表达根据Genbank上发表的gD基因序列，设计合成3对特异性引物，利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD。将其转入BL21（DE3）表达菌中，利用IPTG诱导表达。经酶切鉴定及基因测序均证明原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明，gD融合蛋白主要以包涵体形式在大肠埃希菌中高效表达，成功获得了大小约为48ku的融合蛋白，与预期的蛋白分子量一致。纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg/mL，免疫印迹的结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应，说明其免疫原性良好。二、IBRV抗体间接ELISA方法建立与初步应用以纯化的IBRVgD蛋白为包被抗原，建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。通过对各种反应条件的优化，确定最佳包被抗原浓度为6.4μg/mL，包被时间为4℃过夜，血清稀释度为1:50，血清反应条件为37℃1h，封闭液为5%脱脂乳，HRP-兔抗牛IgG的最佳工作浓度为1:10000，最佳显色时间为37℃15min，经统计学分析后确定的阴阳性临界值为0.219。结果显示，利用本研究所建立的ELISA方法不但特异性强，而且重复性稳定。应用本试验所建立检测方法和IDEXX试剂盒，分别对442份来自黑龙江省部分地区未经免疫的牛血清样本进行检测，结果显示在442份血清样本中102份样本IBR抗体呈阳性，血清阳性率为23.1%，与IDEXX试剂盒达到90.2%的符合率。临床检测结果显示，所建立的检测方法具有特异、敏感和稳定性好的优点，应用前景广阔。关键词：IBRV；gD；原核表达；间接ELISAI AbstractInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV)ismainpathogenofInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBR).IBRVoftencausedsevererespiratoryandgenitaltractinfectionofbovine.GlycoproteingDproteinwaslocatedonthesurfaceofvirusenvelope,whichcanstimulateorganismtogenerateneutralizingantibody,soitcouldbeusedtodiagnosticreagentforIBRV.Inthepresentstudy,prokaryoticexpressionofIBRVgDgenetoestablishanindirectELISAmethodtodetectantibodiesagainstIBRV,expectingthatitcanfastdiagnoseIBR.Thisstudymainlycontainstworesearches:ApairofprimerswasdesignedaccordingtotheIBRVgDsequencesinGenBanktoamplifythecompleteopenreadingframe.PCRproductofgD,containingthreeepitope:gD-A、gD-B、gD-C,wastheninsertedintointotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a-gDrespectively,thentransformtherecombinantplasmidintocompetentcellsofBL21(DE3).AfterinducedbyIPTG,bothofthemweresuccessfullyexpressedandidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandgenesequencing.SDS-PAGEdemonstratedthatgDfusionproteinwaseffectivelyexpressedasinclusionbodyinEscherichiacoliabout48ku.Theirmolecularweightaccordwithexpection.Theconcentrationofthepurifiedrecombinantproteinwas0.128mg/mlforgD.WesternblotprovedthatthepurifiedgDfusionproteincanbeidentifiedbytheimmunizedIBRpositivesera,demonstratingagoodimmunogenicity.AnindirectELISAdetectionmethodwassuccessfullyestablishedusingthepurifiedrecombinantgDproteinasantigen,andthroughoptimalreactioncondition,antigencoatedwasat6.4μg/mL，coatingantigenovernightat4℃,serumdilutionwasat1:50,serumreaction1hat37℃,blockingsolutionat1%skimmilk,HRP-rabbitanti-bovineIgGdilutionat1:10000,andsubstratereaction15minat37℃,thecriticalvalueofnegative-positivesamplewas0.219.Themethodhadahighspecificityandfinereproducibilityanditisrelevanceratio90.2%withIDEXXtest.Themethodwasusedtodetect442bovineserumsamplesfromHeilongjiangprovince,withthepositiverateofserumantibody23.1%(102/442).ThisresultindicatedthatELISAmethodhadafinesensitivityandspecificity,havingverybroadapplicationprospects.Keywords:IBRV；gD；Expression；IndirectELISAII 目录第一章文献综述..............................................................11.1牛传染性鼻气管炎的研究进展.............................................11.1.1牛传染性鼻气管炎的概述...............................................11.1.2牛传染性鼻气管炎发展简史.............................................11.1.3牛传染性鼻气管炎的流行病学...........................................11.1.4牛传染性鼻气管炎的致病性.............................................21.2牛传染性鼻气管炎病毒的概述.............................................31.2.1病毒的形态...........................................................31.2.2病毒的理化性质.......................................................31.2.3病毒的基因组特征.....................................................41.3牛传染性鼻气管炎诊断方法的研究进展.....................................51.3.1病原学诊断...........................................................51.3.2血清学诊断...........................................................51.3.3分子生物学诊断.......................................................6第二章牛传染性鼻气管炎gD基因的截断克隆表达.................................92.1材料...................................................................92.1.1细胞、病毒和质粒.....................................................92.1.2血清与抗体...........................................................92.1.3主要试剂和酶.........................................................92.1.4主要仪器.............................................................92.2方法...................................................................92.2.1牛传染性鼻气管炎gD基因的克隆........................................92.2.2原核表达载体的构建及鉴定............................................112.2.3重组gD蛋白的诱导表达...............................................122.2.4重组蛋白的SDS-PAGE检测.............................................132.2.5重组蛋白gD的纯化...................................................132.2.6纯化后gD蛋白的SDS-PAGE检测........................................142.2.7纯化后gD蛋白的Westernblot检测....................................14III 2.3结果..................................................................152.3.1gD基因的PCR扩增结果...............................................152.3.2基因序列的测定和分析结果............................................152.3.3重组原核表达质粒的双酶切鉴定........................................152.3.4重组质粒的测序分析..................................................162.3.5表达产物的鉴定......................................................162.4讨论..................................................................182.5小结..................................................................19第三章牛传染性鼻气管炎gD蛋白间接ELISA检测方法的建立及初步应用............213.1材料..................................................................213.1.1主要仪器和试剂......................................................213.2方法..................................................................213.2.1ELISA最佳工作条件的确定............................................213.2.2间接ELISA阴、阳性临界值的确定......................................233.2.3特异性试验..........................................................233.2.4敏感性试验..........................................................233.2.5重复性试验..........................................................233.2.6临床样本的初步检测及对比性试验......................................233.3结果...................................................................233.3.1抗原和血清的工作浓度.................................................233.3.2最佳封闭液的确定....................................................243.3.3最佳血清反应时间的确定..............................................243.3.4二抗最佳工作浓度及时间的确定........................................253.3.5最佳底物显色时间的确定..............................................263.3.6ELISA阴、阳性临界值的确定..........................................263.3.7特异性试验..........................................................273.3.8敏感性试验..........................................................273.3.9重复性试验..........................................................273.3.10临床样本检测结果...................................................273.4讨论..................................................................28IV 3.5小结..................................................................28第四章结论.................................................................31参考文献...................................................................32致谢.......................................................................36附录.......................................................................39个人简历...................................................................43V 第一章文献综述1.1牛传染性鼻气管炎的研究进展1.1.1牛传染性鼻气管炎的概述牛传染性鼻气管炎（IBR）是由IBRV引起的牛的一种急热性传染病，又称坏死性鼻[1-3]炎，临床上以流鼻汁、呼吸困难且常伴有呼吸道及气管黏膜发炎等症状为主，同时还可[4]继发感染外乳房炎、龟头炎和阴道炎，严重时可导致怀孕母牛流产。（Baukeoudega，1999）该病毒入侵机体后，多数潜伏在三叉神经或荐神经节中，表现为持续性感染，使牛群长期[5-6]甚至终身带毒，这也是该病给养牛业带来的最严重威胁。感染牛群主要呈阴性感染为主，[9-10]并且当牛群免疫力下降时，开始不断向周围环境排毒，给本病的清除带来很大的困难。1.1.2牛传染性鼻气管炎发展简史关于本病的首次报道是在20世纪50年代的美国,1955年命名为牛传染性鼻气管炎[19](IBR)。随后，有多个学者从病牛不同部位分离出病毒，（SnowdonWA，1964；BrakeFeta1．，1985；AckemrannM，1990）我国最早发现并报道该病是在1981年，周泰冲等在[12]从新西兰进口的奶牛中检测到有该病毒，（周泰冲，1981）之后出现大量相关报道。目前，该病在不同国家和地区呈现不同程度的发病和流行，给全球养牛业造成了巨大的经济损失（FrancisDH．1983，44：1884一1888．）IBR现已被OIE认定为B类传染病，在[7]我国认定为二类传染病，是国际动物贸易及进出境动物检疫中得重点检查对象。1.1.3牛传染性鼻气管炎的流行病学病牛和带毒牛是主要的传染源，IBRV病毒潜伏于病牛和带毒牛的三叉神经和腰、荐神经节中，当病毒和带毒牛受到应激、免疫力下降等影响时体内潜伏的病毒会重新活化，这是病牛和带毒牛就会不定期的往外排毒。IBR的传染主要通过空气和飞沫传播，另外该病可通过直接接触、交配传播。易感宿主较少，自然感染的宿主主要是牛，其中奶牛的感染率比育肥牛低。育肥牛的感染率大于[11]奶牛。但有报道称在水貂、猪的死胎、山羊及水牛的包皮中成功分离出该病毒。（Porter，1975）牛群中该病的发病率主要与自身的个体差异和饲养环境有关。感染牛群因无临床症状或不明显而主要呈隐形感染为主，从而错过对本病防治的最佳时期。该病在牛群中的发病率一般在20%~30%之间，而死亡率相对较低，同等条件下育肥牛的死亡率要较奶牛的1 高，但本病可继发感染多种疾病，例如继发性流产等，使该病的治愈难度大大增加。我国于1980年，在进口种牛中发现该病毒，随后国内的许多学者开始对IBR的流行[4]病学进行了调查。在对青海部分地区养殖场进行血清学检测时，发现阳性率达30.6%。（杨春明，2003）随后在对大量血清样本进行ELISA检测时，结果显示血清阳性率达[5][9]67.1%。（王海燕，2005）在对黑龙江省部分地区奶牛场IBRV的分离时，成功分离出[7]6株野毒株。（王延涛，2007）从世界范围来看，现在除了瑞士、奥地利、丹麦、芬兰等少数国家，通过疫苗接种和对带毒牛群进行隔离等有效措施成功对IBR进行了清除之外，IBR的分布仍呈全球性。在对匈牙利部分大规模养殖场进行检测时，血清阳性率甚至达到64%。（FrancisDH，1993）在对墨西哥某牛场的546头奶牛检测发现阳性率也达到50%以[31][29]上。（Solis，2003）英国西南部地区的调查结果显示血清阳性率高达80%以上。（TurinL，2009）由此可见，IBR给养牛业带来的威胁仍然很大，尽早研制出针对IBR的有效药物及防治措施仍至关重要。1.1.4牛传染性鼻气管炎的致病性牛传染性鼻气管炎病毒对宿主组织具有广泛的嗜侵性，这也是IBRV在致病性方面最[35]主要的特点。不但能够引起呼吸系统疾病，而且还能引起生殖道和脓包性包皮炎等疾病（Kit，1991）。且各亚型间的毒力也有很大差异。有报道称，BHV-1.1b型毒株与生殖道疾[28]病相关，而与呼吸系统疾病相关的毒株类型为BHV-1.1a和BHV-1.2b。（Wentink等，1993）该病毒可导致2种主要的原发性感染，即传染性鼻气管炎和传染性脓疱性龟头炎和外阴道炎，前者还常伴有脑膜炎、结膜炎和流产等的发生，后者主要以局部感染为主经过。按照不同的临床症状，分为：脑膜炎型、眼炎型、呼吸道型、生殖道型和流产型5种：1.呼吸道型。通常发生在每年较冷的月份，病情轻微或严重。轻微病例不易察觉，急性病例则可侵害整个呼吸道。起初以高热症状为主，温度可达到39.5-42℃。精神低迷不振、厌食，鼻粘膜溃疡，并伴有严重的充血现象和流粘液性鼻汁，进而引起患病牛的呼吸困难，出现用嘴大口呼吸的现象，鼻镜和鼻窦部组织因发炎而红肿，故也称该病为“红鼻病”。患病奶牛的产奶量在病程初期就表现为明显下降，若病程持续时间不长，则一周左右产奶量即可恢复，但若病程发生严重变化，则后期产奶量将完全停止。大多数临床病例在10天以上即可治愈，但极少数病情十分严重的患牛，在发病后数小时即出现死亡的现[16]象。IBR流行严重的疫区，可达到70%以上的发病率，但病死率却仅占10%以下。2.生殖道感染型。感染途径主要是与隐性感染的种牛配种所致，一般情况下潜伏期在2 1~3天左右。可发生于母牛及公牛。病初发热，沉郁，无食欲。频尿，有痛感。产乳稍降。阴户联合处皮肤因有粘液性液体的不断外流而受污严重，并波及附近皮肤，阴门和阴道处组织红肿发炎，并伴有严重充血现象，且阴道底部组织有粘液性分泌物渗出。公牛感染的潜伏期一般在2~3天，严重的病例可引起机体高热、包皮和阴经处先发炎然后形成脓疱，[19]且伴有严重的肿胀现象。3.脑膜脑炎型。主要发生于犊牛。体温升高达40℃以上。患牛出现精神开始低迷不振随后又异常兴奋和惊厥的现象，常伴有用力磨牙，口吐白沫，进而出现严重的共济失调，[20]四肢做出划水样动作，随后瘫倒在地，该病程多以急促经过，最终导致死亡。4.眼炎型。一般在临床病例中并不出现明显的全身症状，但可伴随呼吸道型发生。患牛常表现为眼结膜水肿，且严重充血，眼结膜和眼角膜呈炎症经过，最终导致灰黑色的颗粒状坏死莫。角膜轻度浑浊，但不出现溃疡。同时还常引起眼部和鼻内有浆液性分泌物的[21]流出，但该型病例一般很少导致患畜的死亡。5.流产型。该病程在临床上一般以急性经过为主，病毒主要经呼吸系统的血液循环而进入胎膜和胎儿，感染一周后多数可导致胎儿死亡，1~2天后即可排除体外，因为胎儿体[22]内组织常出现自溶现象，所以很难确定是否有包涵体的存在。1.2牛传染性鼻气管炎病毒的概述1.2.1病毒的形态传染染性鼻气管炎病毒（IBRV）是疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒属的[19]成员之一。IBRV是一种双股DNA分子病毒，主要组成部分包括囊膜、衣壳和核酸芯髓。核酸芯髓的直径一般在30~70nm之间，由蛋白质和DNA分子互相缠绕而成。衣壳是由外、[24]中、内三层组成的外观呈六角形的二十面体结构。1.2.2病毒的理化性质IBRV是一种抵抗力相对较强的疱疹病毒，其感染滴度在20℃5天的情况下仅下降10[31]倍（Griffin等，1958）。该病毒能够在PH值6~9的条件下稳定存在，而当PH值下降到4.5~5范围时，表现出不稳定的现象。在56℃仅需30分钟即可完全灭活，温度越高灭活速度越快。该病能在湿度适宜的外界环境下存活一个月以上。由此可见，温度对该病毒有很大的影响。Straub(1986)研究表明，IBRV在0.5%NaOH、0.01%HgCl2、1%漂白粉、[38]1%酚类数秒即可灭活：在5%的甲醛溶液中也只需要1分钟。3 1.2.3病毒的基因组特征[7]IBRV病毒的全基因长度约为138kbp，可编码40种结构蛋白，其中糖蛋白占11种。（刘景华，1997）碱基中G+C比例可达70%以上，由一长、一短两个独特区两侧的重复[9]序列形成。（侯云德，1990）IBRV主要的基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因，其各自功能如下：1.gB基因。该基因具有高度的保守性，根据与Genbank进行序列比较，可用来鉴定[14]疱疹病毒之间的关系，也可利用这一特点来合成引物，建立gB基因的PCR检测方法。（杨娟，2007）编码的gB蛋白能够刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，[45]同时该基因在病毒吸附和入侵宿主细胞时也发挥重要作用。（CamposM，1995）2.gC基因。即GVP-9基因位于HindIII片段上2.4kb的EcoRI-BamHI亚片段上，编码糖蛋白gC。gC蛋白能够参与多种生物学功能，并在其中发挥一定的作用，在病毒的吸附宿主细胞过程中尤其重要，也是11种糖蛋白中表达量最高的。同时，还可参与病毒的复[17]制及入侵细胞的过程。（殷震，1997）gC对病毒的复制是非必需的，但其能够在基因缺失疫苗的构建中发挥重要作用，例如在TK基因缺失的同时，将gC基因当作遗传标记也缺失掉，这样研制出的双基因缺失疫苗具有更好的安全性，同时使用价值也得到了大大的提升。3.gD基因。即GVP-ll基因在1.85kb的XhoI-SamI片段上，全长1251bp，共编码417个氨基酸。gD蛋白与病毒侵入宿主细胞有关，可诱导细胞免疫和体液免疫，是病毒在复制过程中所必需的结构蛋白，位于所感染细胞和病毒囊膜的表面，在免疫试验中，gD引起的[50]细胞免疫要比gB、gC更为强烈和持久。（Hutchings，1990）抗gD蛋白的单克隆抗体能够中和吸附在宿主细胞表面的病毒，且中和滴度值较高（Abdelmagid，1992）因此可作[32]为亚单位疫苗和诊断试剂研制的首选蛋白。4.gE基因。gE基因所编码的蛋白虽然在病毒的复制过程中是非必需的，但其能够以一种细胞特异性的方式，对病毒从感染细胞中的释放进行影响。gE基因的缺失还可对病毒在感染细胞间的传播途径进行干扰，同时gE基因缺失疫苗在临床实践中已得到了广泛应[46]用，并取得良好的免疫效果。（CastrucciG，2005)5.TK基因。TK基因作为病毒的主要毒力基因，一直是科学研究的热点，虽然对病毒的复制是非必需的，但是能够在病毒持续性感染神经组织的过程中发挥重要作用。TK基因的缺失不但使病毒的毒力大大降低，而且使病毒在细胞中的复制能力也下降，进而不易[24]激活处于潜伏期的病毒。因此TK基因经常作为基因缺失疫苗的首选基因。目前市场上4 已有商品化的TK基因缺失疫苗，在临床应用中也取得了较好的效果。1.3牛传染性鼻气管炎诊断方法的研究进展1.3.1病原学诊断采取病变组织明显的病料进行病毒的分离鉴定，常用牛肾单层细胞(MDBK)培养物进行培养，病毒通过大量复制对细胞表现出一定的致病性，正常传代的细胞一般在接种后[13]48~72h出现明显的细胞病变。病变细胞开始由不规则的梭型逐渐变成圆形，并伴有皱缩现象，接着从中心处细胞开始脱落，形成空泡向四周扩展。一般在3~4d后细胞脱落面[15]积可达到75%左右。1.3.2血清学诊断1.3.2.1血清中和试验（SerumNeutralizationTest，SN）SN是检测IBRV常用的方法之一。将病毒接种于MDBK单层细胞培养物中，当病变组织达到70%左右时，收取病毒培养物，在-20℃低温或-70℃超低温条件下进行反复冻融3次，低温低转速离心并吸取上清，对其进行TCID50的测定并分装好。将待检血清放入56℃水浴中进行30min灭活处理，然后以等体积的比例与事先分装好的TCID50抗原进行混合，再37℃孵育1h后接种到MDBK单层细胞培养物中，37℃培养1h，每间隔15min轻晃一次细胞瓶，使其得到充分吸附，然后向细胞瓶中加入维持液，37℃继续培养观察，72h后[20]进行结果判定。同时设病毒抗原和标准阴、阳性血清作对照组。该方法判定的结果与试验中所选用的细胞种类、生长状况以及病毒的TCID50精准情况、孵育时间长短等均有关，[25]同时还具有费时、费力、分辨率低等诸多缺点。因此该方法在临床实践中并不是应用很广，且因IBRV的感染主要以潜伏感染为主，当血清样本检测为阴性时，也不可准确判断牛群中IBRV呈阴性，故在该病的判定方面该方法只作为辅助方法。1.3.2.1酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、操作简便及快速等优点，是血清学检测中应用最为广泛的一种方法，因此在对IBRV抗体的检测中正在逐步取代血清中[23]和试验。因该病主要以潜伏感染为主，故应用ELISA检测方法可对牛群中隐性感染的动物进行筛选，及时制定出合理有效的防治措施。缩短了IBRV在牛群中的传播过程，减小[34]了该病给养牛业带来的经济损失。在ELISA检测方法中，间接ELISA方法最为常用。目前市场上商品化的ELISA试剂盒种类繁多，且功能全面，不但能够检测血清中的抗体，5 [28]而且牛奶中的抗体同样可被检测。[47]早在1990年国外学者Achilles就建立了检测IBRV抗体的双抗夹心ELISA法；1993[32]年Perrin等报道与间接ELLISA方法相比，阻断ELISA方法的敏感性更高些；1994年，[49]Kramps建立检测IBRV抗体的间接ELISA法；1997年VanOischot等研发出针对IBRV[44]的单克隆抗体；1998年Wellenberg等也研发出针对IBRV的单克隆抗体，这两种单克隆[36]抗体均可用于检测区分疫苗接种和自然感染的牛群。1998年国内学者曲新勇等，利用牦牛IBRV85-Y株，按照Cho等的方法制备出相应的[41]抗原，并利用其建立了ELISA检测方法；1998年殷震等研发出利用IBRVIgM抗体捕获ELISA法来检测IBRV的早期感染，通过对试验感染和自然感染的动物血清进行检测，表[18]明当临床症状出现5~10天后，即可在血清样品中检测出IBRV的感染。但因为IBRV的抗体水平一直在临界点处摆动，连续性较差，所以不能及时、有效地做出判断，因此也很难确定是否应该对可疑牛只进行淘汰，这也是目前该方法在临床实践中的最大障碍。目前我国市场上针对IBRV的检测试剂盒主要依赖于国外进口试剂盒，价格相对昂贵，给该病的防治防疫增加了很大的成本，但是国内很多学者已经注意到此点，并陆续开始着[27]手研究。2004年朱远茂等就已成功建立了检测IBRV的间接ELISA方法，并对临床牛[19群血清进行抗体检测]，同时与国外进口试剂盒和中和试验作对比，发现符合率分别在96.39%和95.8%，说明其建立的方法具有特异性强、重复性好的优点。杨娟、王海燕等也[17]先后成功建立了针对IBRV抗体的ELISA方法。1.3.3分子生物学诊断1.3.3.1聚合酶链反应（PCR）技术PCR技术具有简便快速、特异性强和敏高性高等优点，自1985年KaryMullis发明以[39]来，不断得到完善，现已在微生物检测、遗传病诊断等领域得到广泛应用。常用于PCR扩增的IBRV基因片段有TK、gB、gC、gD和gE等基因。1994年Vilcek和VanderEngelenburg[42]等首次报道出PCR技术在IBR诊断上的应用；1994年Kibenge和Yason（1995年）分[35]别以TK基因为模板，成功建立了PCR检测方法；1995年Frederick也以TK基因为目[40]的片段，对4株野毒株进行扩增，得到183bp的特异性片段；1996年Marsri以gB基因[43]为模板，建立了针对精液中gB基因的套式PCR检测方法；1997年Galeota等建立了针[37]对TK、gC基因缺失疫苗鉴别诊断的定量PCR方法；1998张桂红等发表了以gB和TK基因为模板，对多株IBRV毒株进行扩增，均得到大小为339bp和457bp的目的片段，证6 [16]明了该方法的准确性；2005年，陈茹等建立了检测IBRV病毒的gC基因的实时荧光定量PCR诊断技术，该技术拥有快速、准确及灵敏度较常规PCR高103~104倍，该方法适[24]用于对IBR病原的快速鉴定。2012年FuchsM等建立了针对IBRV野毒株和疫苗株鉴别[26]诊断的PCR检测方法。1.3.3.2核酸探针技术Southernblot杂交试验是一种较为敏感的病原核酸检测方法，现已得到国际认可。此法检测的结果可直接用于判定IBRV携带病毒的阴阳性，比传统的血清学检测方法和PCR[30]技术更为准确、敏感。利用斑点杂交法分别建立了检测IBRV病原的方法（Pandita，1995）；[7]后来有研究表明利用该方法可以区分正常细胞是否发生感染。（殷震，1998）7 8 第二章牛传染性鼻气管炎gD基因的截断克隆表达2.1材料2.1.1细胞、病毒和质粒牛肾细胞（MDBK）、IBRV分离株、原核表达载体pET-28a（＋）、DH5α菌种、BL21(DE3)菌种均由本实验室保存。2.1.2血清与抗体牛传染性鼻气管炎的标准阴、阳性血清均购自中国兽药监察所；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛IgG购自Sigma公司。2.1.3主要试剂和酶TrizolReagent购自Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自四季青生物工程材料有限公司（杭州）；NheI、KpnI、SphI、HindⅢ和BamHI限制性内切酶、T4连接酶、DNA快速提取剂盒与质粒提取试剂盒均购自北京博凌科为生物科技有限公司；胶回收试剂盒购自西诺远大科技有限公司（北京）；低分子质量蛋白质Marker和预染低分子质量蛋白质Marker均购自赛默飞世尔（ThermoScientific）科技有限公司；蛋白纯化试剂购自Invitrogen公司。2.1.4主要仪器MyCyclerPCR仪、GelDoc2000紫外凝胶成像系统、半干转印仪：美国BIO-Rad公司；VC105型超声波细胞破碎仪：美国SONICS公司；GeneQuantⅡ基因蛋白定量仪：美国Amershambiosciences公司：CR21型高速立式离心机：日本日立公司（HITACHI）；SIM-F124型制冰机、CR3i型低温离心机：美国Thermo公司；AR3130电子天平、DYY-6B型稳压稳流电泳仪、WD-9405A型脱色摇床、PHS-3C型精密pH计：：北京六一仪器厂DK-8D型电热恒温水槽、DRP-9271型、DRP-9172型电热恒温培养箱、；HZQ-C空气浴振荡器：：上海雷磁仪器厂；Jim-XerⅡ型漩涡振荡器、HZS-H型水浴振荡器、超净工作台、HZQ-QX型空气振荡器：深圳杨兴科技有限公司；Aw1型自动洗板机：奥地利AnthosLabtec公司。2.2方法2.2.1牛传染性鼻气管炎gD基因的克隆9 2.2.1.1引物的设计与合成根据GenBank中已发表的BHV-1gD蛋白的基因序列，利用DNAStar和Prime5.0设计3对引物，并在引物的5’端加入相应的酶切位点和保护性碱基，用于扩增gD基因的3个抗原表位，由试剂公司进行合成。表2.1PCR反应的引物和产物大小Table2.1ThePrimerandproductsofPCRreaction引物名引物序列PCR产物PrimernamePrimersequencePCRproductsgD-AgD-AFTTCCATATGCCTACACCCGCGCCGCGG423bpgD-ARTTGGGTACCTCCTCCTCCCAGTCCCAGCTCGTCGTCgD-BgD-BFCGGGGTACCGGTTCTCCGTATTTTGAGGAGTCG267bpgD-BRCATGCATGCTCCTCCGGCTTCGAGGCTCGGCCAgD-CgD-CFCATGCATGCGGTTCAACGCGCCGGCGCGGTGCGGGTCCGCTGCCCAGAAAG57bpgD-CRTTCAAGCTTAAAGGCCGGCAGCTTTTTTGGCTTTCTGGGCAGCGGACCCGC2.2.1.2PCR扩增及其产物的回收用DNA快速提取试剂盒对收集的MDBK细胞分离培养的IBR病毒上清，进行病毒基因组DNA的提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，体系采用50μL体系：10×PCRBuffer5μL；dNTP(2.5mM)2μL；MgCl(2.5mmol//L)4μL；上下游引物各2（20μmol/L）；模板4μL；TaqDNA聚合酶0.5Ul(1U/μL)；用去离子水补充至50μL。gD基因扩增反应条件为：98℃预变性3min；(98℃10s，55℃10s，72℃1min)x35个循环；72℃总延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，鉴定成功的利用高效胶回收试剂盒进行目的片段的回收，回收产物于-20℃保存。表2.2PCR反应体系Table2.2ReactionsystemofPCR组分加入体积（μL）PCRMix25DNA模板5上游引物2下游引物2超纯水16Total50组分加入体积（μL）2.2.1.3gD基因的克隆（1）gD目的片段与克隆载体的连接将上述PCR反应产物进行回收，并与PMD18-T克隆载体按照体积比1:6加入到10 Eppendorf管中。加入体系为：目的片段DNA4.3μL，pMD18-TVector0.7μL，连接缓冲液5.0μL，充分混匀、瞬离，16℃恒温水槽连接过夜。表2.3T载体连接反应体系Table2.3ReactionsystemofT-Vecorligation组分加入体积（μL)/管pMD18-TsimpleVector0.5LigationSolution5PCR回收产物4.5Total10（2）连接产物的转化从-80℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，立即放人冰水混合物中，待感受态细胞在冰水混合物中融化后，加入20μL连接产物，继续冰浴30min，然后立即放入事先调好的42℃水浴锅中热激90s，再继续冰浴3min后加入1mLLB液体培养基，37℃（180r）摇床上震荡培养1h，使其恢复抗性。3000r离心1.5min，吸弃上层培养基，剩余约100μL重悬菌体，涂布于相应抗性的LB固体培养基上，37℃恒温箱中过夜培养，至出现明显单菌落。（3）重组质粒的提取和鉴定随机挑取长势明显的个单菌落在LB琼脂平板上，将其接种到事先以加入相应抗性的LB液体培养基中，180r/min，37℃恒温摇床培养过夜。取培养过夜后的菌液，按照高纯质粒小提试剂盒说明书来提取质粒DNA。将所提取的质粒经NheI/HindⅢ和BamHI/HindⅢ双酶切鉴定，将双酶切鉴定为阳性的重组质粒送到华大基因（北京）有限公司进行序列测定，与Genbank上已发表的gD基因序列进行同源性分析。2.2.2原核表达载体的构建及鉴定2.2.2.1pET-28a(+)载体的制备分别将pET-28a(+)菌种接种到氨苄抗性、卡纳抗性的LB琼脂平板培养基上，37℃恒温箱培养过夜。挑取明显的单菌落接种到相应抗性的LB液体培养基中，180r/min，37℃恒温摇床培养过夜。按照高纯质粒小提试剂盒说明书来提取pET-28a(+)质粒。2.2.2.2目的基因与表达载体的连接重组质粒pMD-gD和原核表达载体pET-28a(+)同时进行NheI/HindⅢ双酶切，产物进行SDS-PAGE电泳，按照高纯度胶回收试剂盒说明书对目的片段进行回收，将经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后的目的片段和表达载体，按照T4DNA连接酶使用说明书操作，16℃连接过夜，连接反应体系10μL。如图：11 表2.4pET-28a载体连接反应体系Table2.4ReactionsysyermofpET-28aligation组分加入体积（μL)/管pET-28a质粒1.510XT4DNABuffer1回收的目的片段6.5T4DNALigase1Total102.2.2.3连接产物的转化用微量移液器吸取10μL连接产物全部打入放在冰上的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中后，在冰上冷却30min后，取出EP管，放在事先调好温度的42℃水浴锅内，热激90s后，将EP管再放到冰上冷却3min，然后向EP管中加入1mL带有相应抗性的LB液体培养基，用封口膜将管顶部封好，180r/min37℃恒温水浴培养箱内，培养1h后，取出EP管，擦去管外部的水滴，配平后，4℃12000r/min离心1min，在无菌超净台内打开，用移液器吸弃上清留有约100μL液体，用移液器反复吹吸直到沉淀被完全吹散混匀，用灭好菌的玻璃棒均匀地涂在带有相应抗性的LB固体培养基上，最后将平板倒放在37℃培养箱内，注意观察，一般培养12h即可长出明显单个菌落，若菌落过小，则可继续培养，但培养时间最多不可超过16h。用接菌环挑取取长势明显的单个菌落，接种到带有相应抗性的LB液体培养基中，过夜培养后，对菌液进行质粒提取。2.2.2.4重组原核表达质粒的鉴定将提取的原核表达质粒进行双酶切试验鉴定，以此来证明目的片段是否已被准确插入。放入37℃恒温水浴锅内反应4h后，对产物进行核酸电泳，鉴定为阳性的质粒，送到测序公司进行序列测定。双酶切反应体系为40μL，如图：表2.5pET-28a重组质粒的双酶切反应体系Table2.5ReactionsysyermofpET-28adoubledigests组分加入体积（μL)/管pET-28a重组质粒33NheI1.5HindⅢ1.510XBuffer4Total402.2.3重组gD蛋白的诱导表达12 将双酶切鉴定和测序鉴定均正确的重组菌进行诱导表达。挑取长势明显的重组菌的单菌落接种于事先加入相应抗性的LB液体培养基中，过夜培养。将过夜活化后的新鲜菌液转接到新的LB液体培养基中，180r/min，37℃震荡培养至菌液OD值达到0.6左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度分别为0.2、0.5、0.7、1.0mmol/L，37℃诱导时，分别在诱导3h、4h、5h、6h后各取1mL菌液，20℃诱导时，分别在诱导6h、8h、10h、12h后各取1mL菌液，将所取菌液经处理后分成全菌液、上清、沉淀三部分进行SDS-PAGE电泳分析，以此来确定IPTG最佳诱导浓度、诱导时间和蛋白表达形式。pET-28a(+)空载体在相同条件下进行诱导、处理作为空白对照。2.2.4重组蛋白的SDS-PAGE检测（1）制胶：洗净玻璃板并晾干后，用移液器将配置好的12%的分离胶加到两玻璃板之间，注意尽量缓慢加入以免产生气泡，留出浓缩胶所需的空间，胶顶用水封压线，37℃恒温箱放置30min后取出，用手将胶板缓慢倾斜来检查胶体是否凝固完全，若只有水自然流出而胶体全部凝固好后，则可用事先裁剪好的滤纸条将两板系之间的水滴擦干，然后加入配置好的5%浓缩胶至接近胶板上边缘处，垂直插入梳子，在室温条件下静止观察2-3min，若发现梳子间隙处胶体有下沉现象，可及时补少量胶水，小心放置在37℃恒温箱中30min。（2）上样：将事先处理好的蛋白样品用微量加样器垂直加到梳子孔内，注意不要让枪头插到胶体内，每孔上样量为10μL，做好加样顺序的记录。（3）电泳：按照蛋白电泳仪正负极图案正确接通电源后，跑上层胶时使用80V电压进行电泳至上下层胶分界面后，将下层胶电压调高至110V进行电泳，当样品完全跑出胶板底部后，关掉仪器电源。（4）染色：将跑完的胶板从电泳槽中慢慢取出，用起胶器小心的将胶板撬开，并切去多余部分的胶条，再用自来水缓缓冲洗一下，最后将胶块小心地转移至蛋白胶染色液（考马斯亮蓝）中，在水平摇床上缓慢转动，染色3h即可。（5）脱色：取出在染色液中染好的凝胶，先用自来水慢慢冲洗几次后，放到脱色液中进行脱色，脱色前期注意观察换液，一般前两小时内每隔半小时换一次脱色液，最后就可以脱色过夜，这个过程也要在摇床上完成，转速不易过大，防止把胶条弄碎。2.2.5重组蛋白gD的纯化（1）菌体裂解：将表达的重组菌液进行离心，4℃10000r/min20min，上部澄清液体13 弃去，底部沉淀可以用PBS洗两次后，再将沉淀用10%菌液体积的PBS重悬，在冰水混合物中冷却60min后进行超声破碎（Pluson：5s，Plusoff：15s），直到菌液变为清亮，4℃10000r/min20min，包涵体蛋白收集沉淀，-80℃保存。（2）包涵体洗涤：将离心后收集到的沉淀，现用灭过菌的PBS洗，用移液器反复吹吸，至沉淀完全吹散混匀，在天平上配平好后，按上述同样离心方法进行离心后，将上部液体弃掉，再将沉淀用2M尿素按上述同样方法洗涤两次，最后用4M尿素对沉淀进行最后一次洗涤，这一系列操作最好在冰上完成，以免蛋白质发生降解现象。（3）包涵体溶解：用8M尿素（菌液体积的5%）在冰上重悬沉淀，用移液器反复吹吸，直到完全溶解，4℃10000r/min20min，以除去不溶的成分，收集上清于-80℃保存，即所要的蛋白。（4）包涵体蛋白的亲和层析纯化：打开层析柱顶端，加入1~2ml树脂，在重力作用下自然下沉后，依次加入8ml超纯水和1XDenaturingbindBuffer在低温低速振荡器上作用10min，然后从层析柱顶端轻轻的吸弃上层液体，注意不要碰触下层的树脂。将事先处理好的包涵体蛋白gD加入平衡好的层析柱内，在低温低速震荡器上作用1h后，垂直放好层析柱，让树脂在重力作用下自然下沉，打开层析柱底端盖帽，让液体逐滴滴下并收集好，在接近液体与层析柱交界面处，关闭层析柱底端盖帽。向层析柱内加入8mlDenaturingWashBufferA和B分别重复洗涤3~4次并收集洗涤液，最后用20mlDenaturingElutionBuffer对层析柱进行彻底洗脱，收集洗脱液及目的蛋白，将每个步骤收集到的液体短期-20℃保存，长期-80℃保存用以SDS-PAGE检测使用。2.2.6纯化后gD蛋白的SDS-PAGE检测用微量移液器取纯化后的gD蛋白样品各10μL，在分别加入40μL的5×蛋白上样LoadingBuffer，然后在沸水中煮沸10min，最后取20μL加入事先配好的蛋白凝胶孔内，进行SDS-PAGE电泳检测，分析电泳结果。2.2.7纯化后gD蛋白的Westernblot检测将纯化后的gD蛋白样品经处理后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，切去跑完后胶条的多余部分，经电转印至NC膜上，用5%的脱脂奶粉在37℃水平摇床上封闭2h；用5%的脱脂奶粉对一抗所用的IBR标准阳性血清按1:300倍进行稀释，37℃水平摇床上作用1h；酶标二抗兔抗牛IgG用5%的脱脂奶粉以1:5000倍稀释，37℃水平摇床上作用1h；用DAB显色观察结果。14 2.3结果2.3.1gD基因的PCR扩增结果PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，约423bp、267bp、57bp处可见明显的基因片段，与试验的预期大小相符。123450030010050图2.1RT-PCR扩增结果图注1：DL1000DNAMarker；2:gD-A表位扩增结果；3:gD-B表位扩增结果；4:gD-C表位扩增结果Fig.2.1AmplificationresultofRT-PCR2.3.2基因序列的测定和分析结果将双酶切鉴定为阳性的重组质粒送到测序公司进行序列测序，测定结果用DNAStar软件分析，与Genbank中公布的gD基因序列进行对比，结果表明同源性为99.89%，与预期结果相符。2.3.3重组原核表达质粒的双酶切鉴定构建的pET-28a-gD重组表达载体经NheI/HindⅢ双酶切可以切出约747bp的目的片段。15 12750050001000250图2.3重组表达载体酶切鉴定图注1：DL10000DNAMarker；2:pET-28a-gDNheI/HindⅢ酶Fig.2.3Enzymeidentificationofrecombinantplasmid2.3.4重组质粒的测序分析回收的目的基因测序后经DNAStar软件分析，结果显示重组的原核表达质粒中插入的目的片段测序，结果与预先设计的扩增片段相一致。证明目的基因已正确插入到重组质粒中。2.3.5表达产物的鉴定2.3.5.1gD重组蛋白的SDS-PAGE检测将诱导的重组菌和空载体进行SDS-PAGE检测，结果显示诱导的重组菌有特异性条带，分量为48ku，与预期的蛋白分子量相符，而诱导的空载体却没有该特异性条带，证明gD蛋白诱导表达了，通过筛选不同的IPTG浓度、诱导时间和诱导温度，确定gD融合蛋白的最佳诱导条件是IPTG浓度为0.2mmol/L、37℃震荡4h，且主要以包涵体的形式表达。16 1234597kD66kD43kD31kD20kD14kD图2.4pET-28a-gD诱导表达图注：1：gD超声前全菌体2：gD超声后上清3：gD超声后沉淀4：gD未诱导5：标准蛋白MarkerFigure2.4InductionexpressionofpET-28a-gD2.3.5.2gD重组蛋白纯化后的SDS-PAGE检测将包涵体蛋白和可溶性蛋白过Ni柱纯化后，得到预期的融合蛋白条带，其分子质量分别约为48ku，且纯度较高。12130KD72KD43KD26KD17KD图2.6gD蛋白纯化后图注1：标准蛋白Marker；2:gD纯化后Fig.2.6ProteinpurificationofgD2.3.5.3gD重组蛋白的Westernblot检测将纯化后的gD蛋白转印到NC膜上，进行Westernblot分析检测，结果显示，表达的17 融合蛋白在48ku位置出现阳性条带，且所表达的蛋白具有良好的免疫学活性，判定所表达的蛋白为gD融合蛋白。12130KD72KD43KD26KD17KD图2.7gD纯化后蛋白Westernblot检测图注：标准蛋白预染Marker2:gD纯化后Fig.2.7TheWesternblottestoftheproteinpurificationofgD2.4讨论本研究利用分子生物学软件对gD全基因及其编码的氨基酸进行分析，通过分析目的基因的酶切位点和预测目的蛋白的跨膜区、信号肽序列及抗原表位等分子生物学特性，和参考已发表的文献咨询等基础上，选取了抗原决定簇较集中且具有良好的抗原性和亲水性的序列基因，gD基因上随机选取3段线性表位，应用引物设计软件，设计出3对特异性引物，成功扩增出3段目的片段。大肠杆菌表达系统具有培养简便、价格低廉、适应能力强和表达水平高等优点，并且其无论是在遗传学、生物学还是分子生物学方面都已被人们充分了解透彻，应用范围非常广泛。因此应用大肠杆菌表达系统是生产重组蛋白的首选系统。蛋白诱导条件显示，gD蛋白在不同诱导时间、温度和IPTG浓度的条件下均未得到预期的可溶性蛋白，最后确定在37℃、IPTG终浓度为0.2mmol/L且诱导时间在4h时蛋白以包涵体形式得到高效表达。表达成功的目的蛋白经超声破碎裂解后，用亲和层析柱对其进行纯化和浓缩，在SDS-PAGE结果中显示收获目的蛋白的纯度较高，且Westernblot检测结果显示，重组的融合蛋白与IBR标准阳性血清能够发生特异性反应，说明得到的重组18 蛋白具有良好的抗原性，能够作为IBRV检测的优势抗原使用，为牛传染性鼻气管炎的检测盒防疫提供了便利的条件，同时也为针对该病的诊断试剂盒的研制做出一定的物质基础。2.5小结本研究成功扩增出IBRgD部分抗原表位基因，并将其定向克隆到pET-28a原核表达载体上，经双酶切和测序检测鉴定，结果显示成功构建了重组原核表达质粒pET-28a-gD，并且目的基因未发生移码准确插入表达载体。将重组质粒转入到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，通过优化诱导条件，确定重组蛋白的最佳表达条件，经亲和层析柱纯化后，得到了具有良好抗原性且纯度较高的gD融合蛋白，给接下来的研究工作做出了物质上的保障。19 20 第三章牛传染性鼻气管炎gD蛋白间接ELISA检测方法的建立及初步应用3.1材料3.1.1主要仪器和试剂3.1.1.1主要仪器37℃恒温箱、涡旋式振荡器、微量移液器、96孔稀释板槽、酶标板均购自Costar公司；Bio-Rad680型酶标检测仪：上海基因公司。3.1.1.2主要试剂IBR标准阴、阳性血清：中国兽医药品监察所；TMB底物显色液和BSA蛋白浓度测定试剂盒：天根生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG；IDEXX试剂盒；442份牛血清；其他常规试剂均为进口或国产分析纯。3.2方法3.2.1ELISA最佳工作条件的确定3.2.1.1抗原和血清的工作浓度分别按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160五个稀释梯度用包被液对纯化后的蛋白进行稀释，每个稀释度包被8个孔，100μL/孔，4℃包被过夜。用PBST将IBR标准血清按1:20、1:50、1:100、1:200进行倍比稀释，和重组蛋白的五个稀释梯度组成方阵。将包被好的酶标板内液体弃去，每孔用200μLPBST进行洗涤，室温在微型振荡器上震荡3min，倒掉孔内液体，并在吸水纸上排干，重复洗涤3次，然后各加入200μL5%脱脂奶粉封闭液，37℃封闭2h。封闭结束后按上述洗涤方法重复洗涤3次。洗涤后每孔个加100μL倍比稀释好的IBRV阳性血清和阴性血清，37℃作用1h后，按上述同样方法洗涤三次。洗涤结束后，每孔加入100μL按1:5000稀释好的HRP-兔抗牛IgG，37℃作用1h，洗涤后每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃反应15min后，每孔加50μL2mol/L的H2SO4终止液终止反应，在酶标仪上读取每孔阴、阳性血清的OD450nm值，筛选出阳性血清OD450nm值在1附近，且阴性血清OD450nm较低，即为所要筛选的抗原包被浓度和血清工作浓度。3.2.1.2最佳封闭液的确定21 以100μL每孔的最佳抗原浓度包被酶标板，洗涤后分成四组，第一组用明胶包被，浓度为1%和3%；第二组用酪蛋白包被，浓度为3%和5%；第三组用BSA包被，浓度为3%和5%；第四组用脱脂奶粉包被，浓度为3%、5%和10%。200μL每孔，37℃作用2h。洗涤后以1/50倍的稀释倍数加入阴、阳性血清，另做两孔的重复试验，在37℃反应1h。洗涤后加入1:5000倍稀释的HRP-兔抗牛IgG，37℃作用1h。洗涤后加入TMB底物显色液，100μL每孔，37℃显色15min后，每孔加50μL2mol/LH2SO4终止反应。在酶标仪上读取每孔阴、阳性血清的OD450nm值，进而计算出相应的P/N值，最终确定出最佳封闭液的种类。3.2.1.3最佳血清反应时间的确定以100μL每孔的最佳抗原浓度包被酶标板，洗版后，以5%的脱脂奶粉封闭，加入1:50倍稀释的血清，分成三组，在温度均为37℃条件下，改变待检血清的作用时间，每组重复两孔。第一组的作用时间为45min，第二组将作用时间延长到1h，，最后一组将作用时间延长到1.5h。然后加入1:5000倍稀释的HRP-兔抗牛IgG，37℃作用1h。洗涤三次后，加入TMB底物显色液，37℃显色15min，每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止反应。在酶标仪上读取每孔阴、阳性血清的OD450nm值，进而计算出相应的P/N值，最终确定出最佳血清的反应条件。3.2.1.4二抗最佳工作浓度及作用时间的确定以最佳抗原包被浓度包被酶标板，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG以1:5000、1:7000、1:10000、1:20000进行倍比稀释，每个梯度包被两行，与37℃作用时间45min、1h、1.5h组成方阵。通过观察每孔OD450nm值来筛选二抗的最优工作条件。3.2.1.5最佳底物显色时间的确定以最佳抗原包被浓度包被酶标板，洗板后，用5%脱脂奶粉封闭2h，再加入以1:50倍稀释的血清37℃作用1h，加入以1:10000倍稀释的二抗，37℃作用1h，洗涤三次后，每孔加入100μL的TMB底物显色液，进行八组平行试验，第一组底物显色试验为室温显色5min；第二组让底物在室温显色10min；第三组让底物在室温显色15min；第四组让底物在室温显色30min；第五组让底物在37℃显色5min；第六组让底物在37℃显色10min；第七组让底物在37℃显色15min；第八组让底物在37℃显色30min；每组重复2孔，显色结束后每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止反应。在酶标仪上读取每孔阴、阳性血清的OD450nm值，进而计算出相应的P/N值，最终确定出底物的最佳显色时间。22 3.2.2间接ELISA阴、阳性临界值的确定在最佳反应条件下，取30份在病毒中和试验中均呈现阴性的牛血清样本进行ELISA检测分析。利用统计学相关软件进行样本标准方差（SD）的计算，分析结果在S/P>X+3SD时的合理性，在结果准确无误的情况下，可作出阳性判定的可能在99.9%以上。其中S/P=（样本OD450nm—阴性血清OD450nm）/（阳性血清OD450nm—阴性血清OD450nm）。3.2.3特异性试验根据ELISA各步反应所筛选出的最佳条件进行试验，分别用重组蛋白、牛结核（BTB）、和牛流行热（BEV和牛病毒性腹泻（BVD））阳性血清IBRVgD-ELISA方法检测，同时设有IBR阴、阳性标准血清作对照，观察重组蛋白与其它阳性血清是否发生交叉反应。3.2.4敏感性试验-1-10取10份临床自然感染的IBR阳性血清作2-2进行倍比稀释，以ELISA筛选出的最优条件来检测，观察其敏感性。3.2.5重复性试验选取牛传染性鼻气管炎病牛的10份血清，用2次包被的酶标板，进行重复试验，根据公式计算出变异系数。3.2.6临床样本的初步检测及对比性试验以初步建立的ELISA方法检测，采自黑龙江省周边地区的442份未经免疫的牛血清，并与市场上已有的商品化试剂盒（IDEXX）进行对比。3.3结果3.3.1抗原和血清的工作浓度当重组蛋白的包被浓度变小，血清稀释倍数变大时，各反应孔内的OD450nm值也呈递减趋势。当重组蛋白稀释倍数为1:20倍，血清以1:50进行倍比稀释时，阳性血清的OD450nm值在1.0附近，同时阴性血清的OD450nm值也相对较低，且P/N值为4.852相对较高。因此可确定重组抗原和待检血清的最佳工作浓度是当重组蛋白以1:20倍稀释，即重组蛋白的包被浓度约为6.4μg/mL，待检血清的稀释倍数为1/50倍。23 表3.1重组蛋白抗原最佳包被浓度与血清稀释倍数的确定表注“+”表示阳性血清的OD450nm值，“—”表示阴性血清的OD450nm值。Table3.1Confirmoftheconcentrationofrecombinantproteinandserumdilution蛋白稀释倍数血清稀释倍数1/101/201/401/801/160+1.5421.1940.7590.4470.2221:20-0.2950.2170.1690.1210.072P/N5.2275.5024.4913.6943.083+1.1891.0190.6510.3510.2171:50-0.30.210.1710.1180.075P/N3.9634.852308072.9752.893+0.9540.8340.4920.2970.2031:100-0.310.2330.1630.1250.079P/N3.0643.5793.0182.3762.569+0.7560.8650.4720.2840.1941:200-0.3130.270.1780.1270.075P/N2.4153.2032.6522.2362.5863.3.2最佳封闭液的确定虽然选用5%BSA时，阳性血清OD450nm值最高，但同时阴性血清OD450nm值也较高；而选用5%脱脂奶粉时，阳性血清OD450nm值较高，且阴性血清OD450nm值较低，故确定最佳封闭液为5%脱脂奶粉。最佳封闭液的选择281.56+值14—ODP/N0.52001%3%3%5%3%5%3%5%10%明胶酪蛋白BSA脱脂乳封闭液的种类图3.1最佳封闭液的确定图注“+”表示阳性血清的OD450nm值，“—”表示阴性血清的OD450nm值，P/N表示阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm值的比值。Fig.3.1Confirmofthebestofsealedliquid3.3.3最佳血清反应时间的确定24 随着血清作用时间的增加，血清的OD450nm值也逐渐变大，而P/N值却先增加后减小，当阳性血清OD450nm值最趋近1.0，且P/N值最大时，作用时间为37℃1h。血清作用时间1.461.25140.8+值3-OD0.6P/N20.40.210045min1h1.5h血清作用时间图3.2最佳血清反应时间的确定图注“+”表示阳性血清的OD450nm值，“—”表示阴性血清的OD450nm值，P/N表示阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm值的比值。Fig.3.2Confirmofthebestreactiontimeofsealed3.3.4二抗最佳工作浓度及时间的确定当二抗作用时间的增加，各反应孔的OD450nm值也逐渐增加，而当二抗稀释倍数的变大时，各反应孔的OD450nm值却逐渐降低，从中筛选阳性血清的OD450nm最趋近1.0，同时P/N值还最大时，即可确定当以1:10000倍稀释，作用时间为37℃1h时，为所要筛选的最优条件。表3.2酶标二抗最佳工作浓度及时间的确定表注“+”表示阳性血清的OD450nm值，“—”表示阴性血清的OD450nm值，P/N表示阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm值的比值。Table3.1ConfirmofthebestconcentrationofIgG-HRP37℃二抗稀释倍数45min1h1.5h+1.141.241.3951/5000-0.2570.2690.349P/N4.4354.6093.9971/7000+1.0191.1111.36725 -0.2440.2570.339P/N4.1764.3224.032+0.971.0731.1951/10000-0.2060.1980.261P/N4.7085.4194.578+0.6790.9591.0551/20000-0.1510.1920.238P/N4.4964.9944.4323.3.5最佳底物显色时间的确定当显色时间不断增加时，血清OD450nm值也不断增加，当在37℃条件下，显色15min时，阳性血清的OD450nm值最趋近1.0，P/N的比值也最大，且阴性血清的OD450nm值相对其他条件下的值较低，，因此可以确定该条件即为所要筛选的最有条件。显色时间的选择281.56+值14—ODP/N0.52005min10min15min30min5min10min15min30min室温37℃显色时间图3.3底物显色时间的确定图注“+”表示阳性血清的OD450nm值，“—”表示阴性血清的OD450nm值，P/N表示阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm值的比值。Fig.3.3Confirmofthecolorationtimeofsubstrate3.3.6ELISA阴、阳性临界值的确定通过对30份IBR的阴性血清进行ELISA检测，结果如图。其平均值X为0.153，标准差SD为0.022，即当样本S/P>X+3SD=0.153+3×0.022=0.219时判定为阳性。26 表3.330份阴性血清样本的ELISA检测结果Table3.3ELISAtestresultof30Negativeserumsamples30份阴性血清OD450nm值（OD450nmof30negativeserum）0.1420.1150.1640.1820.1830.1620.1310.1800.1390.1690.1210.1380.1700.1590.1720.1370.1580.1770.1250.1910.1410.1710.1180.1290.1620.1270.1810.1560.1410.1533.3.7特异性试验按优化后的ELISA各反应条件进行检测，分别用重组蛋白抗原和牛病毒性腹泻（BVD）、牛结核（BTB）和牛流行热（BEV）阳性血清进行ELISA诊断方法检测，同时设有IBR标准阴、阳性血清作对照，结果表明这几种常见牛病阳性血清，在该体系下均为阴性，表明利用本研究所建立的诊断方法具有较强的特异性。如图：表3.4特异性试验结果Table3.4ResultofspecificitytestBVD阳性血清BTB阳性血清BEV阳性血清IBR阴性血清IBR阳性血清0.1860.1750.1370.1431.2090.1930.1690.1310.1461.2133.3.8敏感性试验-1-10将10份来自临床自然感染的IBR病友血清，进行2-2进行倍比稀释，用该ELISA-7-10方法进行检验，结果显示，10份病牛血清在稀释倍数到2-2仍表现为阳性，故可说明该ELISA方法具有较好的敏感性。3.3.9重复性试验用两次包被的ELISA反应板对10份IBR病牛血清，进行重复检测3次，根据统计学分析，计算出标准偏差SD在0.012~0.051之间，变异系数在1.43%~5.82%之间，均在10%以下，说明该ELISA诊断方法符合要求。3.3.10临床样本检测结果应用本试验所建立检测方法和IDEXX试剂盒，分别对442份来自黑龙江省部分地区未经免疫的牛血清样本进行检测，结果显示在442份血清样本中102份样本IBR抗体呈阳性，血清阳性率为23.1%，与IDEXX试剂盒达到90.2%的检出率。如表3.5所示。27 表3.5临床样品检测结果Table3.5Testresultofclinicalsamples检测方法样本数阳性数阴性数阳性率IDEXX44211332925.6%ELISA44210234023.1%3.4讨论本研究得到的gD重组蛋白为包涵体形式存在，虽然采用尿素溶解变性，但是在后期Westernblot检测结果中显示，其具有良好的免疫原性，可在今后建立ELISA方法时，充当首选抗原的作用。ELISA检测方法因具有特异、敏感等好处，且能够与微量抗原抗体反应而被广泛使用。因为ELISA反应的敏感性直接影响到血清与重组表达蛋白在反应过程中的准确与否，所以在筛选ELISA各步反应条件时，抗原包被浓度和血清稀释梯度的确定是重中之重。本试验主要通过用抗原包被浓度和血清稀释梯度两因素组成的方阵，来观察它们彼此产生的变化规律，以此来确定最终所要筛选的最优组合。而在对封闭液的选择时，将常用的明胶、脱脂奶粉和BSA均考虑在内，而且每种封闭液各设置了三个浓度，以此来放大反应过程中发生的细小变化，在此期间发现BSA浓度为5%时，阳性血清的OD450nm值和P/N均最大，可使由于该条件下的阴性血清的OD450nm也较其他条件的OD450nm值高，所以综合考虑还是有欠稳妥，故将其舍弃，后来发现在用5%脱脂奶粉封闭时，各方面均符合实验要求。经过特异性试验和重复性试验的结果证明，所建立的ELISA方法虽然具备了特异性强、灵敏度高等特点，但是仍需要进一步的完善和优化。3.5小结本试验通过将双因素组合构成方阵的形式筛选出gD重组蛋白的包被浓度为6μg/mL，包被条件为4℃过夜；待检血清以1:50倍稀释，37℃反应1h；封闭条件为5%脱脂乳，37℃作用2h；二抗的最佳工作浓度为1:10000，37℃作用1h；显色条件为37℃15min。ELISA反应的阴阳性临界值为0.219。应用该方法和市场上的商品化试剂盒一同对同批次的临床样品检查，并计算出两种方法各自的检出率，在进行对比并计算出百分比，结果显示该方法与商品化试剂盒的阳性血清检出率达到90%以上的一致性，说明该方法的临床应用价值很客观。该方法成本低廉，操作简单、快速、所以通过进一步的完善，在不久的将28 来一定会在临床实践中得到大范围的使用。29 30 第四章结论1.成功诱导表达出gD重组蛋白，且经Westernblot检测证明其具有良好的免疫原性。2.建立了间接ELISA检测方法，与IDEXX试剂盒检测符合率达90.2%。31 32 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致谢岁月如梭，转眼间，两年的研究生求学生活即将结束，回首往昔，那些一起奋斗和欢笑的日子仍历历在目。黑龙江八一农垦大学以优良的学习风气和严谨的科研氛围教我求学，以博大的情怀胸襟和充实的校园生活育我成人。值此毕业之际，我谨向所有关心、爱护、帮助过我的人们献上最真挚的感谢和最美好的祝愿。本论文的研究工作是在我的导师倪宏波教授的悉心指导下顺利完成的。倪老师渊博的专业知识、丰富的实践经验、严谨的治学态度、诲人不倦的高尚师德、豁达的处事方式时刻感染着我，对我影响颇深。倪老师不仅传授我学术知识，而且教诲如何我做人，虽然只有短暂的两年时光，却使我终身受益无穷。本研究论文从选题到完成，每一步都是在倪老师的耐心指导下完成的，倾注了老师大量的心血，在此我向我的导师倪宏波教授表示深切的谢意和诚挚的祝福。本研究论文能够顺利的完成，同时也离不开其他各位老师、同学的关心和帮助。在此我要感谢刘思国和闻晓波老师，在论文开题、中期考核、校外实习及预答辩期间所提出的宝贵意见和建议。感谢各位师兄师姐以及师弟师妹们，在科研试验过程中给予我的帮助和鼓励，让我懂得团队合作的重要性。回想毕业论文写作的整个过程，虽有艰辛，但也让我除却了浮躁，经过这些困惑和思考，让我更加深切地体会到研究的精髓和意义，因此倍感珍惜。最后，我要感谢我的父母和家人，是他们在我这二十多年的求学生涯中，一如既往的支持我、鼓励我，时刻给予我无微不至的关怀和照顾，让我懂得世间亲情的无价与可贵。同时还要感谢黑龙江八一农垦大学的每一位成员，是你们帮我谱写出这最美丽动听的青春篇章，愿友谊长存。37 38 附录1.0.01mol/LPBS(pH7.4)配置量：1LNaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g加去离子水定容至1L经高压蒸汽灭菌（121℃，20min），分装成每瓶200ml，于4℃保存。2.5.6%NaHCO3配置量：100mLNaHCO35.6g去离子水加至100ml过滤除菌活高压除菌（115℃,10min），分装成每瓶15ml，于4℃保存。3.双抗配置量：100mL青霉素1.0×106IU链霉素1g0.9%生理盐水加至100ml过滤除菌，分装小瓶（每瓶15ml），于4℃保存。4.200mmol/L谷氨酰胺（100浓度）配置量：100mL谷氨酰胺2.922g去离子水加至100ml过滤除菌，分装小瓶（每瓶15ml），于-20℃保存。5.0.5MEDTA(pH8.0)配置量：100mL配制方法：称取18.61gNa2EDTA2H2O，置于烧杯中，加入约80mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约2gNaOH)，定容至100mL，高温高压灭菌，室温39 保存。注意：pH值至8.0时。EDTA才能完全溶解。6.50×TAEBuffer配置量：100mL配制方法：称取24.2gTris碱，量取5.71mL乙酸（17.4mol/L）和20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容至100mL。7.IPTG(200mg/mL)配置量：10mL配制方法：在8mL灭菌水中溶解2gIPTG后，加灭菌水定容至10mL，用滤膜过滤除菌，分装成1mL每份贮存于-20℃冰箱保存。8.LB液体培养基配置量：200mL配置方法：称取胰蛋白胨2g、酵母抽提物1g、NaCl2g，加去离子水将培养基定容至200mL，高温高压灭菌，4℃保存。9.LB固体培养基配置量：200Ml配制方法：称取胰蛋白胨2g、酵母抽提物1g、NaCl2g、琼脂粉3g，加去离子水将培养基定容至200mL，高温高压灭菌，4℃保存。10.5XTris-HCl配置量：1L配置方法：在900mL去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50mL10%（W/V）的电泳级SDS贮存液，用去离子水定容至1L。11.考马斯亮蓝R-250染色液配置量：100mL配制方法：称取0.125g考马斯亮蓝R-250置于烧杯中，量取30mL甲醇加入该烧杯，搅拌均匀；加入100mL冰醋酸，搅拌均匀；加入65mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。12.考马斯亮蓝脱色液配置量：1L配制方法：量取300mL甲醇和100mL乙酸，加去离子水定容至1L，充分混匀后室温40 保存。13.转膜缓冲液配置量：1L配制方法：称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS、200mL甲醇，加去离子水定容至1L，室温保存。14.PBS配置量：1L配制方法：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4于800mL蒸馏水中溶解，用浓盐酸和2M、10MNaOH调节PH值至7.4，加水定容至1L，高温高压灭菌，室温保存。15.PBST配置量：1L配制方法：1LPBS中加入0.5mLTween-20,在旋涡式搅拌器上搅拌均匀，30天内有效，室温保存。16.5%脱脂奶粉配置量：30mL配制方法：在20mLPBST中加入1.5g脱脂奶粉，溶解后用PBST定容至30mL。17.碳酸盐包被缓冲液配置量：1L配制方法：在800mL的去离子水中加入1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3，充分溶解后，用浓盐酸和NaOH调节PH值至9.6，定容至1L,，4℃保存。18.封闭液（1）5%脱脂奶粉配置量：100mL配制方法：称取5g脱脂奶粉加PBS充分溶解后，定容至100mL。（2）1%明胶配置量：100Ml配置方法：称取1g明胶加PBS充分溶解后，定容至100mL。（3）1%BSA配置量：100Ml41 配制方法：称取1gBSA加PBS充分溶解后，定容至100Ml。现用现配，短期内使用可4℃保存。19.抗体稀释液配置量：100mL配制方法：称取5g脱脂奶粉加PBST充分溶解后，定容至100mL。20.终止液配置量：200mL配制方法：在100mL去离子水中逐滴加入21.7mL浓盐酸，用去离子水定容至200mL。42 个人简历姓名：齐晓雪性别：女民族：汉籍贯：黑龙江省兰西县出生日期：1989.11.19婚姻状况：未婚教育背景2009.09~2013.07黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物医学专业2013.09~2015.07黑龙江八一农垦大学动物科技学院兽医硕士专业硕士期间发表的论文2014年第06期王彬，齐晓雪等.猪流行性腹泻病毒与大肠杆菌混合感染的病例报告畜牧兽医科技信息201406:31-3243