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时间:2021-04-17
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1、最新实验四间充质干细胞的培养及鉴定一-药学医学精品资料一、实验目的1、掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。2、熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。3、掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化,鉴定间充质干细胞的多向分化潜能,并掌握其诱导分化的方法。二、实验材料、试剂与器材1材料:100-150gSD大鼠。2试剂:乙醚,75%酒精,L-DMEM低糖培养基,胎牛血清,小牛血清,Percoll细胞分离液,1.5MNaCl溶液,0.25%胰酶,FITC标记的羊抗鼠CD29抗体,FITC标记的羊抗鼠CD90抗体,FITC标记的羊抗鼠CD71抗体,PE
2、标记的羊抗鼠CD106抗体,FITC标记的羊抗CD45抗体,β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C,Hoechst33258,油红O,20g/L硝酸钴溶液,20g/L硫化铵,50%甘油,多聚赖氨酸(PLL)。3仪器:细胞培养箱,微量移液器,倒置相差显微镜,细胞培养皿,荧光显微镜,电子天平,pH计,离心机,超净工作台,电热恒温鼓风干燥箱,电热恒温水槽,超声波清洗机,立式压力蒸汽灭菌器。5.另取一干净离心管A,加入10mlPercoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入,切记不能冲破Percoll分离液面,用8mlDMEM完全培养基冲洗培养皿,后用同样的方法将其加入离心管A。6.250
3、0~3000r/min,离心30min后,可见离心管A中液体基本分三层,用吸管吸去上层红色培养基层,将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出,移至另一干净离心管B,切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。7.将20mlPBS加入离心管B,反复吹打混匀,1800r/min离心10min。8.弃上清,重复步骤7。9.弃上清,加入5ml完全培养基,吹打混匀,接种于培养瓶中。【实验结果与分析】每天注意观察培养的原代细胞的形态,并拍照记录。【思考题】1、密度梯度离心法的原理是什么?2、间充质干细胞的原代培养过程是什么,有哪些方面是需要注意的?(二)间充质干细胞的传代、冻存及复苏1.当细胞融合度达
4、到90%左右时,将培养液吸出,加入PBS冲洗细胞两次。2.加入0.25%的胰酶2ml,置于37℃培养箱中2~3min,取出在显微镜下观察,当80~90%的细胞回缩成圆形,振摇后脱离瓶底时,移入超净台。3.传代:加入3mlDMEM完全培养基终止消化,用吸管反复吹打瓶底,将细胞悬液移入离心管中,1200r/min,离心10min。弃上清,加入10ml培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。4.冻存:加入3mlDMEM完全培养基终止消化,用吸管反复吹打瓶底,将细胞悬液移入离心管中,1200r/min,离心10min。弃上清,加入1ml冻存液(FCS:DMSO:L-DMEM=2:1:7)吹打混匀,置于冻
5、存管中,4℃放置30~40min,-20℃放置1h,-80℃过夜,再移入液氮罐中。1.复苏:1)将细胞从液氮中取出,37℃轻微摇晃,使细胞快速融化。2)75%酒精擦拭冻存管,将细胞转移到离心管中,加入5ml培养基,1000r/min离心5min。3)弃上清,加入5ml完全培养基混匀细胞,接种于25cm2培养瓶中。【实验结果与分析】试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程,以及各环节的注意事项。【思考题】1、细胞传代培养的目的是什么?2、细胞冻存与复苏的原则是什么,怎么操作?冻存液的成分以及作用是什么?(三)BMSCs鉴定1BMSCs表面抗原鉴定:1)22×22mm盖玻片酸缸浸泡过夜,自来水冲洗1
6、0次,三蒸水冲洗3次,浸泡于75%酒精中备用。2)包被时取出75%酒精中的盖玻片,在酒精灯上烘干,放入35mm2培养皿中,吸取0.5ml浓度为50μg/ml的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上,37℃放置1h,回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30min,后在超净工作台内内晾干。3)将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于35mm2培养皿中,将第5代BMSCs用0.25%胰酶消化,按1×105/ml密度接种,37℃、5%CO2条件下培养。4)待细胞70%汇合时细胞去除培养基,进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达。用PBS清洗,加入4%多
7、聚甲醛固定,4℃过夜。PBS洗3次后,分别滴加用PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+TritonX-100(0.2%)稀释的单克隆抗体孵育,室温90min。PBS洗3次。细胞核用Hoechst33258染色,室温放置5min并冲洗。用50%甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察拍照。【实验结果与分析】观察表面抗原的免疫荧光染色结果:【思考题】1、免疫荧光染色的步骤是什么,需要注意什么?2、怎样用荧光显微镜
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