最新实验四间充质干细胞的培养及鉴定一-药学医学精品资料.ppt

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1、最新实验四间充质干细胞的培养及鉴定一-药学医学精品资料一、实验目的1、掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。2、熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。3、掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导分化的方法。二、实验材料、试剂与器材1材料：100-150gSD大鼠。2试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5MNaCl溶液，0.25%胰酶，FITC标记的羊抗鼠CD29抗体，FITC标记的羊抗鼠CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE

2、标记的羊抗鼠CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20g/L硝酸钴溶液，20g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。3仪器：细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。5.另取一干净离心管A，加入10mlPercoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8mlDMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。6.250

3、0~3000r/min，离心30min后，可见离心管A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。7.将20mlPBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800r/min离心10min。8.弃上清，重复步骤7。9.弃上清，加入5ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。【实验结果与分析】每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。【思考题】1、密度梯度离心法的原理是什么？2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方面是需要注意的？(二)间充质干细胞的传代、冻存及复苏1.当细胞融合度达

4、到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。2.加入0.25%的胰酶2ml，置于37℃培养箱中2~3min，取出在显微镜下观察，当80~90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。3.传代：加入3mlDMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200r/min，离心10min。弃上清，加入10ml培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。4.冻存：加入3mlDMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200r/min，离心10min。弃上清，加入1ml冻存液（FCS：DMSO：L-DMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻

5、存管中，4℃放置30~40min，-20℃放置1h，-80℃过夜，再移入液氮罐中。1.复苏：1)将细胞从液氮中取出，37℃轻微摇晃，使细胞快速融化。2)75％酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入5ml培养基，1000r/min离心5min。3）弃上清，加入5ml完全培养基混匀细胞，接种于25cm2培养瓶中。【实验结果与分析】试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及各环节的注意事项。【思考题】1、细胞传代培养的目的是什么？2、细胞冻存与复苏的原则是什么，怎么操作？冻存液的成分以及作用是什么？（三）BMSCs鉴定1BMSCs表面抗原鉴定：1）22×22mm盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗1

6、0次，三蒸水冲洗3次，浸泡于75%酒精中备用。2）包被时取出75%酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入35mm2培养皿中，吸取0.5ml浓度为50μg/ml的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，37℃放置1h，回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30min,后在超净工作台内内晾干。3）将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于35mm2培养皿中，将第5代BMSCs用0.25%胰酶消化，按1×105/ml密度接种，37℃、5%CO2条件下培养。4）待细胞70%汇合时细胞去除培养基，进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达。用PBS清洗，加入4%多

7、聚甲醛固定，4℃过夜。PBS洗3次后，分别滴加用PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+TritonX-100(0.2%)稀释的单克隆抗体孵育，室温90min。PBS洗3次。细胞核用Hoechst33258染色，室温放置5min并冲洗。用50%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照。【实验结果与分析】观察表面抗原的免疫荧光染色结果：【思考题】1、免疫荧光染色的步骤是什么，需要注意什么？2、怎样用荧光显微镜