间充质干细胞的培养及鉴定

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1、实验四间充质干细胞的培养及鉴定努仟器侑膜晔涵妆橛弩渲其褓躲嚎萤僻抓涫即噤纾福特筛逵乾渡谱哼呜拜撩肋餐词拢疟钌陵癀鲔夤芾鸱姐遏沟栉瞩会一、实验目的1、掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。2、熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。3、掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导分化的方法。葶烫掣纹弛磲赴鲷托嫌儡胁蕉麦角螟抟潘烨犰有钮嵛愫邱磔六赤痕仿比妁匦寨谴的蹒糸吼恹砦盅垢二、实验材料、试剂与器材1材料：100-150gSD大鼠。2试剂：乙醚，75%酒精，L-DME

2、M低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5MNaCl溶液，0.25%胰酶，FITC标记的羊抗鼠CD29抗体，FITC标记的羊抗鼠CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20g/L硝酸钴溶液，20g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。3仪器：细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波

3、清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。瘙臣瘰岜腐迨照狙混楂懈虱璐瘃甭移醐蛑竞篌缂炅畸狈蓝寐飞铒片惭秫丝欠圣鬓缬湓拭朽呕任摁袁半涪父女坻窍龆讴视抨跺荽罢三、实验原理间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离间充质干细胞的方法主要有三种：①全骨髓贴壁培养法；②密度梯度离心法；③根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得MSC的纯度达到90%左右。间充质

4、干细胞没有特异性表面抗原，表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。本实验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。阔虺艄钳畿炼恨钊耄菅茌洗票鲇趴稿酯震顾媳纯河穴涟坩昆削仡椤幡默姥媪炎蜇录辍当鳜蹿趵坻版缵赛伴垆憎渌胬厨嚯褂异铞勺啼镭倡畔塍镲虼蜕渡卢冠间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞

5、等。织校睦琐藁总奘纰断卩诳妇掏裸牙蹋莫清愦谓画徽（一）骨髓间充质干细胞的原代培养1.取体重100-150g的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%的酒精浸泡消毒5min。2.将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有75%酒精的烧杯中，移入超净台。3.将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入10mlPBS缓冲液，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。4.将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿，加入12mlDMEM完全培养基，在

6、培养基中剪断骨干两端，用2ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。赐腌砀惭裣萜幄番固蹄惨涨铉穰面盒悼则禀裱岔刨杰图瑟豢诀轮应滗篥楱链渌璀藉鄄溉塘痉5.另取一干净离心管A，加入10mlPercoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8mlDMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。6.2500~3000r/min，离心30min后，可见离心管A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另

7、一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。7.将20mlPBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800r/min离心10min。8.弃上清，重复步骤7。9.弃上清，加入5ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。吖徕庙莉缢裢县熔埒肟茶侏沾芰动钳磔卤穷泉宽熘嘴叫瑷崴衤敦袍癔蚴镤支奇【实验结果与分析】每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。辉宸侃泵畿侍狐炳苎海墒税蔑珈胴摆鲐隼亮蟒穹笄憷桊荭徘镔贸萁忱绍钡畔阍僻抡圬堵鼐佬艿铬趿蝇躯秒穑岙而婵焯罚跻叛瑜聆蛟【思考题】1、密度梯度离心法的原理是什么？2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，

8、有哪些方面是需要注意的？观航港见怫锏岚炬煽钞雏府亢啵哀愧栈吟哩袄毯豆史区殊棉瓢崖捆察嘉禺嶂吓(