山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定论文

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1、山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定论文【摘要】目的分离培养山羊的间充质干细胞，并为其在骨组织工程研究中的应用奠定基础。方法应用常规的密度梯度离心法结合贴壁培养法从山羊骨髓中分离间充质干细胞，并通过观察分离培养细胞的形态，检测其表面的CD分子表达，以及RTPCR和免疫组化病理染色方法证实成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能来对细胞进行鉴定。结果分离的细胞具有成纤维细胞样形态，第三代细胞的表面分子CD29和CD44阳性率为98.70%、99.54%，而CD62L和CD45阳性率为1.10%和0.73%。RTPCR

2、和免疫组化病理染色证实分离细胞具有成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能。结论成功地分离培养山羊的骨髓间充质干细胞，使山羊间充质干细胞应用于骨组织工程的研究成为可能。【关键词】骨组织工程；山羊；骨髓间充质干细胞；鉴定Abstract:ObjectiveToisolateandculturegoatmesenchymalstemcells(MSCs)frombonemarrogoatbonemarroethods.Theidentificationofcelladebycellmorphous,expressionof

3、cellepitopeprofile,andmultilineagedifferentiationofosteogenesis,chondrogenesis,andadipogenesisassayedRTPCRandimmunohistologystaining.ResultsThecellsmunohistologystainingshoultilineagedifferentiationpotentialofcell.ConclusionMSCsgoatbonemarroarroesenchymalste

4、mcells;identification间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是多潜能干细胞，具有向骨、软骨、脂肪等组织分化的能力［1］。目前研究发现其来源广泛，存在于骨髓组织、脂肪组织和脐血中等［24］。来源于骨髓组织中的MSCs具有增殖快、诱导成骨能力较强特点，因而成为目前骨组织工程中重要的种子细胞来源，其与支架材料复合后移植体内能明显改善骨缺损的修复［5］。本实验对来源于山羊骨髓组织的MSCs进行分离、纯化和鉴定，为将其应用于组织工程骨相关实验研究奠定基础。1材料与方法1.1

5、MSCs的纯化与培养抽取体重为25kg雄性山羊（由第三军医大学动物中心提供）髂骨骨髓10mL，等量稀释后加入到含有等体积的密度为1.07g/mL的Percoll（Amresco）分离液的离心管中，以3000r/min离心20min，吸取中间乳白色云雾状有核细胞层，漂洗后加入DMEM/F12培养基（Hyclone）和体积比10%的胎牛血清（Hyclone），制成单细胞悬液，以2×106/cm2的细胞密度接种培养瓶，3d后首次全量换液，弃去大量悬浮细胞，以后根据培养基的颜色，每2～3d换液。待细胞长满单层后，用含有

6、0.25%胰酶的EDTA溶液（0.01%，g/mL），CD44（购自Abcam，大鼠单克隆抗体，1mg/mL）；二抗为FITC（购自SouthernBiotech，兔抗大鼠，1mg/mL）和PE（购自生物晶美，羊抗小鼠）。同上方法取第一代至第三代的MSCs进行CD29和CD44双染。1.3体外分化1.3.1成骨分化取传3代后的MSCs接种后，用成骨诱导培养基（DMEM/F12培养基中加入0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L的β磷酸甘油和0.05mmol/L的维生素C，均购自Sigma）替换普通培养基，

7、每周换液2次［6］。1.3.2成软骨分化取传3代后的MSCs，1000r/min离心5min在离心管底形成细胞团，将其移入培养瓶，轻轻加入含有0.2mmol/L维生素C和1ng/mL重组人的TGFβ1（北京博奥森）的DMEM/F12培养基继续培养，每周换液2次［7］。1.3.3成脂分化取传3代后的MSCs，在DMEM/F12培养基中加入1%胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松和1nmol/L胰岛素（购自Sigma），每周换液2次［7］。1.4RTPCR收集成骨、成软骨和成脂诱导21d的细胞，以未经任何诱导的

8、第三代MSCs作为对照，按照QiagenRNeasyMiniKit的使用说明书，将细胞裂解、抽提和纯化得到相应的RNA。通过分光光度计测得RNA浓度，按照Promega试剂盒说明，在制定20μL的逆转录反应体系中加入1μg的RNA和0.5μg的随机引物，在MMLV（RTaseH）逆转录酶的作用下，25℃保温5min，42℃保温60min，70℃灭火15min，得到cD