[精品]羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析

《[精品]羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析摘耍目的：探讨体外培养的羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）、一般细胞的生物学特性。方法：应用免疫组化学方法，对培养的骨髓基质的间充质干细胞（MSCs）进行细胞生长测定。结果：培养的MSCs粘附贴壁、呈纺锤状，并有多个突起；传代培养MSCs的潜伏期为24小时，对数增殖期3〜6天，接种后第8天MSCs生长逐渐缓慢，进入平台期；免疫细胞化学染色后显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44阳性。结论：培养的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征。❷关键词羊骨髓间充质干细胞体外培养鉴定分析o资料与方法❷

2、采用健康中国山羊，月龄10个月。主要试剂为水合氯醛、安定、肝素、粉剂DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、淋巴分离液、多聚甲醛（PFA）、小鼠抗山羊CD44、免疫组化学试剂盒等。其主耍仪器包括细胞培养瓶、24孔细胞培养板、1ml冻存管、超净工作台、离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、振荡器等。❷实验方法：①羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）[1〜3]的分离和培养。把10个月龄的山羊，用水合氯醛和安定各lml肌肉注射麻醉，固定四肢,术区剃毛,常规消毒铺巾。于骼后上輒处骨髓腔穿刺,抽取骨髓5ml,与等量的DMEM培养液充分混匀。将骨髓1000转/分离心5分钟,弃

3、含油脂的上清，加入DMEM液吹匀至15ml,见离心管分为清晰的5层，即脂肪层、血小板DMEM培养液层、单核细胞层、淋巴细胞分离液、红细胞和口噬细胞层。吸取中间含有BMSCs的单核细胞层有核细胞层，再加入DMEM5ml吹打漂洗，1500转/分离心5分钟，去上清，重复3次，在沉淀中加入原代培养液10ml,反复吹打制成单细胞悬液，接种到50ml培养瓶,置37°C、5%C02、饱和湿度孵箱内孵育，3天后首次全量换液，以后每3〜4天换液1次，倒置显微镜下观察细胞变化。待85%左右的瓶底细胞融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，洗涤后再以5X104个/ml的密度接种

4、，称为第一继代（P1）,待细胞再次长至90%汇合时，同法传代，称为P2、P3等。②羊BMSCs的生长曲线测定。选择好P3、P5、P7细胞悬液，接种于24孔培养板，每孔lml,每天各取3孔消化贴壁细胞并计数，计算均值连续8天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴,描绘细胞传代后生长曲线。③羊BMSCs的免疫组化学鉴定。取P3代的羊BMSCs的细胞悬液接种到加有盖玻片经多聚赖氨酸涂片的24孔板，当盖玻片上的细胞密度达1X105/ml吋，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定过夜，PBS振洗，3%双氧水灭活内源性活性酶，滴加正常兔血清，室温封闭20分钟；滴加一抗工作液（小鼠抗山羊CD44

5、）,4°C过夜，PBS振洗；用DAB室温显色25分钟，脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察记录。④羊BMSCs的冻存。取P3代对数生长期的羊BMSCs细胞（冻存前全量换液），用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，加入等量的冻存液，吹打均匀，以1ml/支移入无菌冻存管密封。-20°C2小时后，移至-80°C深低温冰箱中冻存8〜10个小时，然后移入-196°C的液氮中。⑤冻存羊BMSCs的复苏。取出冻存管后，迅速投入加有37°C温水的烧杯中移入超净操作台，然后将融化的细胞悬液移入离心管，加入完全培养液10~15ml，吹打均匀，加入完全培养基以1X105个/ml接种于

6、50ml培养瓶中，24小吋后全量换液1次，以后常规培养。❷结果❷羊BMSCs的形态学特征：原代细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形,胞体透亮，折光性好，细胞核呈卵圆形，有较多的骨髓造血系细胞混杂。3天后换液可去掉大部分悬浮细胞，9天换液后悬浮细胞基木去除，瓶底聚集生长的细胞形态多不规则，15天可见多处聚集生长的细胞群脱落，中心细胞为梭形，可见2〜3个突起。根据生长情况每4~7天进行1次传代，传代细胞接种后2〜4小吋即迅速贴壁、伸展，6~10小吋活细胞基本完成贴壁；2~5天细胞呈梭形或不规则的三角形，也有扁平形带突起的细胞，胞内可见2〜4个核均匀分布。传代细胞的生长较原代较

7、快，接种后7天即可铺满整个培养瓶底。冻存复苏的活细胞率为95.6%,细胞贴壁较传代细胞稍慢，24小时后仍有部分细胞未贴壁，8天即可铺满培养瓶底。❷羊BMSCs的牛长曲线测定：三代细胞生长周期基本一致，接种培养后前2〜3天，生长较缓慢，为生长迟滞期；3天后细胞生长加速，达到对数生长期；7〜8天细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。光镜下观察显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原CD44有阳性表达。❷讨论❷本组实验采用梯度密度离心法，操作简便，成木低。但MSCs体外培养时具有底物粘附性，造血细胞等因无法贴壁而随换液被清除。结果显示，所培养细胞的干细胞P3、P5