第五章-目的基因的获取ppt课件.ppt

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1、.第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。.第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。酶切.由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene.二、随机片段化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则.1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个

2、切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A(同尾酶).2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片段。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片段。.1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表

3、了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。.①保护dNTP的3’端P和5’端–OH（1）原理1.磷酸二酯法加入的脱氧单核苷酸起始脱氧单核苷酸.②带保护的单核苷酸连接带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来.③用酸或碱的脱保护80%乙酸.（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。.原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法.将第

4、一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸连接处有三个酯键！.固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5’DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲基),3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物C.目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用。.3、亚磷酸三酯法(1)脱二苯甲基保护基加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二对甲氧基三苯甲

5、基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5’—OH。(2)活化新的碱基核苷酸单体2的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。.(3)缩合反应在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。(4)盖帽反应加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。(5)氧化反应形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不

6、稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。.三价五价.如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上洗脱下来，最后除去NH4OH，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。要注意的问题:合成方向3’→5’核苷酸单体的磷酸基团在3’端亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。.化学合成的DNA片段一般在200bp以内。二、化学合成DNA片段的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（

7、1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）.T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链.2.互补延伸连接法预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物.1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低.DNA合成仪5.合成人工接头或衔接

8、物含有各种酶切位点人工接