《目的基因的获取》PPT课件

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1、复习题1、-----热稳定性较好，可用来进行特定核苷酸序列的体外扩增；2、-----可以在体外以mRNA为模板合成cDNA；3、为避免载体自连，可以用------将DNA的5’磷酸基团去除。4、----可以去除DNA片段中突出的单链尾巴。5、寄主控制的限制与修饰现象涉及到的两种酶是-----和-------。6、质粒的复制类型可分为——和——两种。7、质粒的三种构型在琼脂糖凝胶电泳中速度最快的是——。8、pUC18/19是——载体。9、pUC118、119是——载体。10、------年被公认为基因工程元年。

2、第四章目的基因的获取第一节化学合成目的基因第二节PCR扩增获得目的基因第三节筛选基因文库获取目的基因第四节转座子标签法获得目的基因第五节图位克隆获得目的基因第六节mRNA差别显示技术获得差异表达的基因第七节酵母双杂交系统获得目的基因第一节化学合成目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列；较短的DNA片段。应用范围：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探针3）人工接头4）较小的基因固相亚磷酸三酯法一、基本原理二、支持物可控微孔玻璃珠（CPG）三、单体3’位二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的羟基用甲基或β-氰乙基保护5’位二甲氧

3、基三苯甲基（DMT）四、反应步骤第一步----核苷酸单体1的去封闭（Deblocking）去除CPG所连核苷上的DMT，以暴露5’羟基第二步----核苷酸单体2的活化（Activation）形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体第三步----连接（Coupling）亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸缩合第四步----盖帽（Capping）封闭未反应的核苷酸单体1第五步----氧化（Oxidation）三价磷氧化为五价的磷多次循环直到合成所需的长度，用浓氨水将DNA从固相上洗脱下来，真空抽干，样品溶于适量水中进行纯化分析

4、。化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基可控微孔玻璃珠CPG连接臂五、基因的组装目前合成能力200b以内，若要合成更长的基因，则需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，称为基因的组装。第二节PCR扩增获得目的基因一、PCR扩增目的基因的基本原理PCR：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。5‘5‘目的基因5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5

5、‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123二、特点：1.反复循环便于获得大量的基因拷贝；2.多用于基因检测，如用于基因重组表达，须进行DNA序列分析。三、逆转录PCR（RT-PCR)mRNAcDNAPCR1、已知目的基因序列的RT-PCR2、从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCRmRNA5‘AAAAAA3’RT-GSP逆转录5’AAAAAA3’RT-GSP变性、退火5‘AAAAAA3’3’5’GSP3’5’5’3’已知目的基因编码的蛋白N端部分氨基

6、酸序列信息，可以以此设计特异引物，从总RNA中获得目的基因。N端C端氨基酸序列：ValPheAsnAlaTrpLysAspHis核苷酸序列:GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA(T/C)引物1引物2简并引物1：GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA共16种简并引物2：GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA共16种反义引物：oligo（dT）12-18已知序列mRNA5’AAAAAA3’TTTTTTT5’(反义引物)逆转录mRNA5’AAAAAA3’T

7、TTTTTT5’(反义引物)加入简并引物1、变性、退火、延伸TTTTTTTT5’引物1AAAAAAA3’加入简并引物2、变性、退火、延伸AAAAAAA3’TTTTTTTT5’四、依据基因部分序列信息获得基因全长序列1、反向PCR(inversePCR,IPCR)2、盒式PCR3、RACE技术反向PCR：根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。RE已知区域RE酶切酶连引物A1、S1引物A2、S2克隆测序盒式PCR：是利用cassete（即人工

8、合成的带有适当限制酶的粘性末端较长的双链DNA分子）和cassete上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效方法。RACE技术：通过PCR技术进行cDNA末端快速克隆的技术。以mRNA为模板逆转录成cDNA第一条链后，用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5‘之间的未知序列的方法，分别称3’-RACE或5‘-RACE。第三节筛选基因文库获取目的基因一、基因组文库的构建二、cDNA文库的