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1、2021/7/23PCR法获取目的基因1第五章PCR法获取目的基因目录PCR技术的创建PCR技术的原理PCR的反应体系和条件PCR的类型和应用PCR法获取目的基因2021/7/232PCR法获取目的基因2021/7/23PCR法获取目的基因3DNA，生命的蓝图2021/7/23PCR法获取目的基因4PCR技术PolymeraseChainReaction多聚酶链式反应一、PCR技术的创建——KaryB.Mullis1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使
2、Khorana的设想得到实现。3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。4.1988年，第一台PCR仪问世。5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。6.1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。2021/7/235PCR法获取目的基因2021/7/23PCR法获取目的基因6KaryB.Mullis（1944－）http://www.karymullis.com三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolyme
3、raseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)DNA聚合酶引物引物1977年Sanger的测
4、序技术M13噬菌体引物DNA聚合酶2021/7/237PCR法获取目的基因1983年Mullis的构思94℃55℃37℃2021/7/238PCR法获取目的基因1983年春夏之交的一个晚上，Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA的想法。他开车时,感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成DNA。缺点:DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶（来自于Thermusaquaticus，水生栖热菌)1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术2021/
5、7/239PCR法获取目的基因2021/7/23PCR法获取目的基因10二、PCR技术的原理1.PCR技术的原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物（2）PCR过程：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链；②复性：55℃左右，引物与模板D
6、NA单链互补配对结合；③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。2021/7/2311PCR法获取目的基因加热变性复性复温2.PCR技术依赖于DNA的变性和复性DNA的变性：加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNADNA的复性（退火）：解除变性的条件后,变性的单链DNA
7、可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复2021/7/2312PCR法获取目的基因3.PCR技术的特点1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的扩增量达230个拷贝（109拷贝）2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。4）用途广泛：生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学2021/7/2313PCR法获取目
