PCR法获取目的基因.ppt

《PCR法获取目的基因.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、PCR法获取目的基因112班马晴晴孙婷婷张娜金漪倩胡斐徐振鹏PCR技术的定义及其发展历史PCR技术的原理PCR的反应体系和条件PCR法获取目的基因PCR技术的未来展望PCR技术多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction)PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。一、PCR技术的创建1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延

2、伸,克隆DNA的设想。2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。4.1988年，第一台PCR仪问世。5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。二、PCR技术的原理1.PCR技术在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环

3、合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。PCR原理（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个基本反应步骤构成①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链；②复性：55℃左右，引物与模板DNA单

4、链互补配对结合；③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链2.PCR技术的特点1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的扩增量达230个拷贝（109拷贝）。2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

5、三、PCR的反应体系和基本步骤H2O35μL10×PCR反应缓冲液5μL25mmol/LMgCl24μL4种dNTP4μL上游引物（引物１）0.5μL下游引物（引物２）0.5μL模板DNA(约1ng)0.5μLTaq酶0.5μL1.反应体系组成成分（总体积：50L）模板DNAdNTP引物BufferMg2+预变性模板DNAdNTP引物BufferMg2+TaqDNA聚合酶94℃5min2.基本程序PCR排管Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+循环仪94℃55℃72℃72℃5～7min循环2

6、5～35次扩增出的目标基因琼脂糖凝胶电泳转移点样进行电泳扩增出的目的基因3.PCR反应条件循环参数（1）预变性：94℃5min（2）变性：94℃20s-45s使双链DNA解链为单链（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45s左右。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性。（4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。（5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。

7、（6）延伸补齐：72℃5min—10minPCR技术的注意事项1.合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。2.吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3.试剂分装所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PC

8、R试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。4.防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。四、PCR法获取目的基因由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。1.T载体克隆PCR获取的目的基因具有3‘-5’外切酶活性的DNA聚合酶（如p