目的基因获取.ppt

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1、第四章目的基因的获得目的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系一、基因的基本结构特征一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：转录启动区、核糖体识别区、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录终止区。（一）原核生物基因的组成——操纵子启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段；SD区：糖体16SrRNA识别、结合mRNA的位置；转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核

2、的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹。基因区：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）转录启动区：编码蛋白的启动子(RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区：TATAA/TA区（Hogness框）、CAAT框、GC框。转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。（二）真核生物基因的组成二、目的基因的获得方法目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：化学合成法、cDNA文库法、PCR法和RT-PCR法。将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。特点：①只能合成小于100个碱基特定序列；②自动化程度较高；③合成速度较快。方法：

3、磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法（一）化学合成法化学合成法的用途合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因制备探针、引物、接头（二）cDNA文库法cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库

4、与cDNA文库的比较构建cDNA文库的一般步骤总RNA（totalRNA）提取提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2.mRNA的分离纯化原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。3.cDNA第一链的合成OligodT法：用OligodT作引物，合成c

5、DNA的第一链。反转录酶mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物不适用于大分子量的mRNA随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物，从mRNA的多个位点开始合成cDNA。基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。4.降解mRNA模板用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。3’引物mRNAmRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物cDNA第一链3’5’5’cDNA第一链3’5’引物或RNaseH碱5.cDNA第二链的合成自身引导法用RnaseH消化

6、后，cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。S1核酸酶消化会使获得的双链cDNA5’端有几对碱基缺失置换合成法以第一链合成产物cDNA-mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.置换合成法6.cDNA与载体连接在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。接上人工接头粘性

7、末端CCCCCC末端转移酶cDNA文库的查询用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析（三）PCR法目前实验室最常用。扩增时容易突变：高保真的PCR引物，DNA序列测定。1.直接从基因组中扩增提取基因组DNA作模板；根据目的基因序列设计引物；PCR扩增。适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增2.从mRNA中扩增:RT-PCR提取基因组总RNA；反转录合成总cDNA作模板；根据目的基因序列设计引物；PCR扩增。适合扩增真核生物基因。目的基因的引物1反转录成目的基因cD

8、NA第一链目的基因的引物2目的基因cD