基因工程—获取目的基因.ppt

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1、基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，

2、这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNA一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组

3、DNA---基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分）②基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。①基因文库的分类依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方法2、利用PCR技术扩增目的基因参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开

4、始连接脱氧核苷酸生物体内DNA分子复制的条件DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。①②③④⑤ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端含羟基3，端5，端3’5’5’DNA的复制方向DNA分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物与两条单链结合在80~100℃的温度范围内，DNA的双

5、螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性PCR原理高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。PCR反应的条件①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶；⑤控制温度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的缓冲液中进行。1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个步骤──变性、复性和延伸。循环之前的一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR的

6、反应过程950C变性550C复性720C延伸第一轮②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸2、PCR的反应结果3、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成