基因工程目的基因的分离.ppt

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1、第五章基因工程目的基因的分离第一节基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（简称限制酶restrictionenzyme），是指在细胞内能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在此位点对DNA分子进行切割的一种内切酶。1952年，Luria和Human发现宿主控制性限制现象。1、限制—修饰系统包括限制酶和甲基化酶。1968年，Meselson和Yuan，Linn和Arber从E.coli菌株K和B中发现了Ⅰ型限制性核酸内切酶，接着，Smith和Wilcox于1970年分离纯化了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶。宿主细胞对噬菌体感染的限制-修饰作用2、限制性核酸内切酶的类型

2、（2）Ⅱ型限制性核酸内切酶Ⅰ型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。Ⅰ型酶需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。III型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切割位点，在识别点的3’—端24～26bp处。它的切点与识别位点是一致的。由于Ⅱ型酶的该特点，且反应中不需要ATP、S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而是基因工程中使用的主要工具酶。（1）Ⅰ型和III型限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分为3种类型：I型、II型和III型3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基

3、本特点（1）识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，其长度一般为4～8个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，N是代表任意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。（2）具有特定的酶切位点A、粘性末端a、5′突出粘性末端如限制酶Pst-Ⅰ,它识别6核苷酸序列，产生4核苷酸5’-粘性末端序列。5’-C↓TCGAG-3’5’-CTCGA--G-3’3’-GAGCT↑C-5’3’-G--AGCTC-5’A′B′CCBAA′B′N′BAA′B′BAABCC′B′A′ABNB′A′ABB′A′b、3′突出粘末端B、平端如：从流感噬血菌（Hae

4、mophilusinfluenzae）分离出来的一种限制酶，其识别序列和切割位点为：5′-A↓AGCTT-3′-5’-A--AGCTT-3′3′-TTCGA↑A-5′-3’-TTCGA--A-5′例限制酶HaeIII，它识别4核苷酸序列，切割点产生平口末端。5’-CG↓CC-3’5’-GG--CC-3’3’-CC↑GG-5’3’-CC--GG-5’（3）Ⅱ类限制一修饰系统的甲基化酶4.限制性核酸内切酶的特异特点维持维持性甲基化酶：指新合成的DNA链上的甲基化与模板DNA链上的甲基化位置相同。构建性甲基化酶：该酶可在非甲基化的DNA链上新甲基化。1（1）同裂酶来源不同但识别相同核苷酸序

5、列并有相同切割位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为CCGG，切割位点均为C↓CGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ和MspⅠ均可对其切割，如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶，则MspⅠ可以切割它，而HpaⅡ就不能切割此序列。（2）同尾酶来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后DNA分子产生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。SalⅠ5’-G↓TCGAC-3’5’-G--TCGAG-3’3’-CAGCT↑G-5’3’-CAGCT-G-5’和XhoⅠ5’-C↓TCGAG-3’5’-C--TCGA

6、G-3’3’-GAGCT↑C-5’3’-GAGCT-C-5’两个粘性末端再连接后，产生5’-GTCGAG-3’3’-CAGCTC-5’该DNA既不能为SalⅠ也不能为XhoⅠ所识别。5、限制性核酸内切酶的命名6、限制性核酸内切酶识别序列的长度与识别位点的频率（1）第一个字母是酶来源物种的属名的第一个字母，且大写；第二、三个字母是酶来源的种名的前两个字母，用小写。该3个字母是酶的名称；（2）若有特殊的菌株，在3个字母后加菌株号，用变种或品系的第一个字母，且大写；（3）如果一种特殊寄主菌株分离出几个不同的限制修饰体系，按照发现和分离的顺序用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、III……表示。如从大肠杆菌（E

7、scherichiacoli）R株分离的第一种限制酶称为EcoRI在DNA中，若A、T、G、C四种核苷酸以相同频率出现，那么，一段DNA中，某一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结合的位点的数量为1/4n(n为识别序列的长度)。二、DNA连接酶三、DNA聚合酶能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键，1、T4DNA连接酶可连接带匹配粘末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。2、大肠杆菌DNA连接酶是基因工程