目的基因的分离.ppt

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1、目的基因的分离生物与食品工程学院目的基因的分离酶切核糖体PCR差异显示筛选目的基因直接通过限制性内切核酸酶进行切割适用于质粒，或病毒等较小的DNA分离核糖体上的mRNA已知基因编码的蛋白质抗体筛选目的基因聚合酶链式反应简称PCR（PolymeraseChainReaction）PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。利用PCR扩增

2、目的基因需要知道目的序列的全序列或其两侧序列（引物）。常规的PCR技术合成的DNA片段长度有限，一般在1Kb以内。差别显示技术1.扩增两个系统的全mRNA特异性弱引物2.电泳比较差别传统的减法杂交技术原理：尽量除去两种样品中共同的序列，从而使目的基因序列得到有效富集。操作步骤：mRNAmRNAcDNA剩余的单链cDNA即为目的基因杂交DNA插入诱变法分离目的基因原理：当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其临近位置时，一般会诱导该基因发生突变。步骤：1.插入已知DNA2.通过插入的已知DNA筛选突变基

3、因片段3.依据突变基因从野生植株中筛选目的基因表达序列标签表达序列标签（EST）是指基因序列中，一段能特异地标记或表征基因的序列，它包含有足够的信息显示出该基因与其它基因的区别1.从cDNA文库中随机克隆2.测序3.与已知数据比对(序列数据库)应用基因定位筛选目的基因依据目的基因在染色体上的位置来进行克隆染色体步移法利用已知基因从基因组文库中筛选与其有共同序列的克隆。以新克隆DNA片段作为探针，选出与之有部分重叠，且更加靠近目的基因的新克隆。同理………..直至克隆到目的基因。基因的酶法合成基因的本质就是一段

4、核苷酸序列。化学合成法合成的寡聚核苷酸片段一般为150~200bp基因组文库筛选目的基因某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个受体菌群体就是该生物的基因组文库。基因组文库cDNA文库次级基因组文库基因组文库筛选目的基因1.构建基因组文库2.筛选所需的克隆子3.扩增4.分离得到目的基因构建基因组文库的步骤1.制备基因组DNA并片段化物理方法：搅拌超声波生物化学方法：酶2.DNA片段与载体重组连接富集处理：一定大小范围的DNA3.重组DNA导入受体菌CDNA基因文库的构建cDN

5、A：RNA逆转录不同的发育阶段mRNA表达不同不包含内含子、转录启动子和终止子cDNA文库可以分为：表达型和非表达型CDNA文库与基因组文库的比较cDNAcDNA文库复杂性低，筛选容易。能在细菌中表达基因组文库包含所有遗传信息可用于分析非编码区和调控序列通过基因组文库筛选目的基因制备核酸探针进行杂交筛选制备抗体进行免疫杂交筛选利用噬菌体表面显示技术核酸探针目的基因或其同源序列已知编码的蛋白序列已知推测核苷酸序列容易出现假阳性1.影印平板到滤膜2.破坏噬菌体外壳，并使噬菌体DNA结合在滤膜3.与含有放射性标记

6、的探针杂交4.洗去膜上的非结合探针5.显示免疫杂交筛选蛋白产物已知cDNA表达文库筛选方法同核酸探针表面显示方法筛选基因组文科库使目的基因表达产物显示在噬菌体、细菌或细胞的表面，然后根据产物的某些生物化学性质检测筛选。与外壳蛋白组成融合蛋白抗体亲和纯化，分离出含有目的基因的噬菌体作业：从基因组文库筛选目的基因的方法有那些?ThankYou!